Некоторые клетки глиомы обладают свойствами нейронов и глии одновременно

Многие годы догма нейробиологии утверждала, что потенциалы действия в нервной системе могут генерироваться исключительно нейронами, но не клетками глии. Относительно недавно на мышах было показано, что одна из популяций предшественников олигодендроцитов обладает такой активностью. Наличие подобных клеток у человека оставалось под вопросом, однако теперь возможность их существования lдаже в нормальном мозге была показана в ходе исследования электрофизиологических свойств глиом.

Глиома — наиболее распространенный тип опухолей головного и спинного мозга, возникающих из клеток глии. Уже известно, что нейроны могут влиять своей электрической активностью на клетки глиомы — между ними формируются синапсы, работа которых способствует росту опухоли.

Однако электрофизиологические свойства самих клеток глиом были изучены недостаточно. В недавно опубликованной работе ученые совместили морфологический, электрофизиологический и генетический подходы для описания отдельных опухолевых клеток. Они воспользовались методом Patch-seq, который объединяет локальную фиксацию потенциала (пэтч-кламп) с транскриптомикой единичных клеток. Из срезов свежеудаленных опухолей отбирали отдельные клетки, которые сначала анализировали методом пэтч-кламп, а затем экстрагировали ядро на транскриптомный анализ. Часть клеток вместо секвенирования характеризовали морфологически.

В анализ вошли образцы девяти пациентов: шесть опухолей с мутациями в генах изоцитратдегидрогеназы (гены IDH1 и IDH2, IDH^mut-глиомы), две без таких мутаций (IDH^WT-глиомы) и один образец здорового мозга. Их классифицировали двумя способами — по электрофизиологическим и по транскриптомным характеристикам, — сравнивая их с известными клеточными типами. В общей сложности авторы проанализировали 148 клеток. 105 из них были схожи с известными типами клеток нервной ткани и были классифицированы как пирамидальные клетки (PC), тормозные нейроны (IN) или клетки глии (GL). К последним относили все электрически инертные клетки.

Определение принадлежности клеток к нормальным или опухолевым, а также к тому или иному клеточному типу оказалось нетривиальной задачей. Поэтому авторы разработали специальный софт — SCRAM (Single Cell Rule Association Mining). Он соотносит транскриптомный профиль с клеточным типом с помощью нейросетей, затем анализирует однонуклеотидные вариации (SNV) и вариации числа копий (CNV). Алгоритм позволяет относить клетку к одному или нескольким типам, что дает возможность анализировать «гибридные» разновидности клеток. Клетки классифицируются как опухолевые, если они имеют не менее двух опухолевых признаков: соответствующая аннотация нейросетью, экспрессия минимум двух онкомаркеров (SOX2, EGFR, или PDGFRA), наличие CNV или SNV в генах IDH (R132H/R132C) или EGFR.

SCRAM-анализ 95 клеток, исследованных Patch-seq, классифицировал все 17 клеток с электрофизиологией интернейронов как ГАМКергические нейроны, 24 из 41 пирамидальной клетки — как глутаматергические нейроны, все 16 клеток с электрофизиологией глии, то есть без потенциалов действия, — как подтипы глии и/или клетки глиомы. 13 пирамидальных клеток были классифицированы как возбуждающие нейроны с ГАМКергическим транскриптомом, что укладывается в парадигму развития нервной системы, в которой все нейроны сначала являются ГАМКергическими возбуждающими.

Кроме того, часть клеток имела морфологическое сходство с глиомными клетками и нейрональными предшественниками (NPC), а также обладала особыми электрофизиологическими свойствами: высоким входным сопротивлением и слабыми одиночными потенциалами действия. Эти клетки авторы назвали гибридными (HC). Интересно, что HC были обнаружены в четырех IDH^mut глиомах и здоровом образце, но не в IDH^WT. SCRAM выявил транскриптомное сходство гибридных клеток с клетками-предшественниками олигодендроцитов (OPC), ГАМКергическими нейронами и опухолевыми клетками. Клетки с таким профилем транскрипции авторы обозначили как GABA-OPC. Данные scRNA-seq подтвердили высокий уровень экспрессии ключевых ферментов биосинтеза ГАМК и рецепторов ГАМК в GABA-OPC. Большинство опухолевых GABA-OPC активно экспрессировали потенциалзависимые ионные каналы (Na_v), которые участвуют в генерации потенциала действия.

GABA-OPC транскрипционно похожи на клетки OPC поздней стадии развития и олигодендроциты ранней стадии дифференцировки. Так, около 48% OPC в здоровом мозге обладают схожими с GABA-OPC молекулярными профилями.

GABA-OPC оказались характерны для IDH^mut-опухолей и могли составлять 40% глиомы, в то время как в IDH^WT их количество мало и составляет около 2%. Анализ данных из Атласа ракового генома показал, что процент GABA-OPC клеток гораздо выше в глиомах низкой степени злокачественности (low-grade), чем в глиомах высокой степени злокачественности (high-grade). Это согласовалось с медианой выживаемости — 84,5 месяца при низком содержании GABA-OPC и 156,9 при высоком.

Используя иммуноокрашивание с антителами к IDH132H, OLIG2 (маркер олигодендроцитов) и KI67 (маркер пролиферации), а также зная соотношение типов клеток, авторы выяснили, что GABA-OPC почти не пролиферируют (активны около 1,5% клеток) в IDH^mut-глиомах, что хорошо для выживаемости. Интересно, что в Patch-seq эксперименте максимальное значение G2/M-показателя, отражающее пролиферативную активность, было у трех GABA-OPC.

Однако в IDH^WT-глиомах GABA-OPC клетки имели высокое значение показателя G2/M, что говорит об их пролиферации. Из-за сильной гетерогенности IDH^WT-глиом не существует специфичных к ним антител, поэтому ученые решили проверить, как влияет электрическая активность клеток IDH^WT-глиом на пролиферацию опухоли. Для этого они получили трансгенных мышей с de novo IDH^WT-глиомами, экспрессирующими и каналородопсин ChR2 для оптогенетической стимуляции потенциалов действия (в тех клетках, которые к этому способны). После 10 дней фотостимуляции и введения BrdU иммуноокрашивание выявило бóльшую пролиферативную активность в опухолях с экспрессией ChR2. То есть присутствие возбудимых клеток в IDH^WT-глиомах потенциально может способствовать их пролиферации.

Самой интригующей находкой, по словам авторов, стало обнаружение двух гибридных клеток (из двух образцов глиом IDH^mut), которые сохранили гомозиготность IDH1 дикого типа и эуплоидию, несмотря на то, что были выделены из опухолей с мутацией IDH1R132H. Хотя этих клеток две, 5 миллионов прочтений Patch-seq на клетку обеспечивают достоверность данных. Таким образом, электрофизиология гибридных клеток не уникальна для опухолевого состояния. А наличие трех таких клеток в неопухолевом образце говорит о возможности их присутствия в здоровом человеческом мозге. Транскриптомный профиль гибридных клеток характерен для большой субпопуляции предшественников олигодендроцитов, которые составляют 3–4% всех клеток серого вещества и 8–9% клеток белого вещества мозга млекопитающих. Поэтому исследователи предполагают, что вклад клеток с электрической активностью HC в физиологию мозга может быть значительным.