Новые липидные наночастицы для редактирования клеток легких

Генетические причины врожденных болезней легких (таких как муковисцидоз) давно известны, однако эффективной терапии пока не существует. Многообещающий подход – доставка инструментов для редактирования генома, например, системы CRISPR-Cas9, в эпителий дыхательных путей или другие клетки легких. Хороших результатов удалось добиться in vivo с помощью аденоассоциированных вирусных (AAV) векторов. Однако после их применения в клетках долгое время экспрессируются Cas9 и гидРНК. Более того, AAV иммуногенны, что мешает повторному применению этих векторов. Также существует проблема их относительно небольшой вместимости.

Преодолеть эти ограничения можно с помощью липидных наночастиц. Тем не менее, существует проблема доставки CRISPR-системы в клетки легких из-за их высокой специализации и наличия слизистого барьера. В клетки эпителия дыхательных путей плохо проникают вирусные и невирусные векторы. В новой работе ученые из США и Канады синтезировали библиотеку биоразлагаемых липидов для синтеза наночастиц и доставки мРНК в клетки дыхательной системы, а также провели их скрининг.

Всего авторы получили библиотеку из 720 новых липидов с десятью различными хвостами и 72 головными группами. Все липиды содержали сложные эфирные и карбонатные группы, что увеличивало их биоразлагаемость, снижало риск развития побочных реакций и способствовало введению множества доз.

В наночастицы с кандидатными липидами в составе загружали мРНК люциферазы, после чего ими обрабатывали клетки A549. Для опытов in vivo липиды с одинаковыми головными группами объединяли, после чего вводили мышам внутримышечно. Через шесть часов измеряли люминесцентный сигнал. Так же поступали с липидами с одинаковыми хвостами. Самые эффективные наночатица доставляли в легкие мышей через трахею (интратрахеальная инстилляция). В результате отобрали девять липидных наночастиц.

Способность этих наночастиц доставлять мРНК SpCas9 и гидРНК оценили на клетках HEK 293T, экспрессирующих GFP (HEK-GFP). Шесть из девяти наночастиц позволили провести нокаут GFP в более 80% клеток, что больше, чем у контролей Lipofectamine MessengerMAX (64%) и RNAiMAX (35%). Так, эффективность наночастицы RCB-4-8 достигала 95%.

Состав RCB-4-8 оптимизировали для доставки в легкие. В результате экспрессия люциферазы в легких после доставки наночастиц через трахею усилилась. Более того, менее 30% биоразлагаемых RCB-4-8 оставались в легких через 48 часов после введения, что намного меньше, чем у других наночастиц (более 90% у MC3). Это может говорить о меньшей токсичности новых наночастиц.

Чтобы оценить эффективность редактирования, Cre-мРНК доставляли в легкие репортерных мышей Lox-3xSTOP-Lox-tdTomato. С мРНК происходит трансляция рекомбиназы Cre, которая катализирует рекомбинацию, в результате которой экспрессируется красный флуоресцентный белок tdTomato. Мышам вводили одну или три дозы наночастиц, несущих Cre-мРНК. Через три дня после последней дозы обследовали легкие. Экспрессию tdTomato оценивали с помощью проточной цитометрии. В результате экспрессия флуоресцентного белка была отмечена в 42% и 53% клеток легких соответственно. Дальнейшие анализы подтвердили, что чем больше доз, тем больше эффективность редактирования. Также RCB-4-8 могут доставлять груз как в реснитчатые клетки, так и в клетки Клара.

Далее тех же репортерных мышей использовали, чтобы оценить возможность доставки системы CRISPR-Cas9. мРНК SpCas9 упаковали вместе с гидРНК в RCB-4-8. В результате также активировалась экспрессия tdTomato. Наночастицы доставляли в легкие мышей в низкой и высокой дозах с интервалом в два дня (всего три дозы). На седьмой день оценивали экспрессию флуоресцентного белка. В результате доставки низкой и высокой доз были отредактированы 3% и 7,2% клеток соответственно. Если гидРНК доставлять отдельно в AAV, то эффективность повышается до 17%.

Ранее полученные наночастицы позволяли редактировать геномы 15,1% клеток легких. Однако эти наночастицы доставлялись внутривенно и в первую очередь редактировали эндотелиальные, а не эпителиальные клетки.

В настоящее время авторы работают над стабилизацией наночастиц, что позволить распылять их и доставлять в легкие при вдыхании. Также в планах проверка эффективности наночастиц на животных моделях различных болезней легких.

Новые наночастицы доставляют препарат для химиотерапии и активируют иммунитет