Новый метод определения метилирования ДНК позволит неинвазивно диагностировать рак

В настоящее время для анализа метилирования цитозинов ДНК с однонуклеотидным разрешением наиболее широко применяется метод бисульфитного секвенирования. Тем не менее, он обладает рядом недостатков. Метод основан на реакции бисульфитной конверсии, превращающей немодифицированный цитозин в урацил, который при секвенировании читается как тимин. Это жесткая химическая реакция, приводящая к частичной деградации ДНК. Кроме того, стратегия химической реакции по неметилированному основанию неоптимальна: немодифицированные цитозины составляют около 95% всех цитозинов генома, и достигнуть полной модификации такого большого числа оснований сложно. Эти проблемы удалось решить ученым из Великобритании с помощью метода секвенирования при участии TET-фермента и пиридинборана (TET-assisted pyridine borane sequencing, TAPS). За счет мягкой химической реакции по 5-метилцитозину и 5-гидроксиметилцитозину для полногеномного анализа метилирования требуется меньше ДНК, чем при бисульфитном секвенировании. Это позволило ученым адаптировать методику для диагностики рака по статусу метилирования внеклеточной ДНК плазмы крови.

В методе TAPS диоксигеназа TET окисляет 5-метилцитозин до 5-гидроксиметилцитозина, а далее до 5-карбоксилцитозина. Пиридинборан восстанавливает 5-карбоксилцитозин до дигидроксиурацила, который читается при секвенировании как тимин. Как и бисульфитное секвенирование, TAPS не позволяет различить 5-метилцитозин и 5-гидроксиметилцитозин.

В настоящее время не существует эффективных неинвазивных методов диагностики гепатоцеллюлярной карциномы и аденокарциномы протоков поджелудочной железы, что приводит к поздней постановке диагноза. В новой работе для диагностики этих заболеваний по паттернам метилирования использовали внеклеточную ДНК пациента. Для анализа достаточно 1–3 мл плазмы крови, из которой выделяют порядка 10 нг ДНК. Для сравнения, с использованием бисульфитного секвенирования не удается достичь достаточного качества картирования метильных меток, даже если взять 5 мл плазмы.

Общий уровень метилирования CpG-островков не отличался между образцами пациентов с раком и контролей и составлял около 75%. Глобальное гипометилирование было обнаружено лишь в нескольких образцах пациентов с раком на поздних стадиях. Разница в метилировании, которая позволяла идентифицировать образцы пациентов, наблюдалась в регуляторных регионах генома — в основном в энхансерах для гепатоцеллюлярной карциномы и в промоторах для аденокарциномы протоков поджелудочной железы.

Кроме того, авторы показали, что данные о метилировании ДНК позволяют делать выводы об источнике внеклеточной ДНК. Как и ожидалось, преобладает ДНК крови и иммунных клеток, а ДНК других тканей содержится в меньших количествах, но достаточных для распознавания солидных опухолей.

Работа была проделана на небольшой группе пациентов (всего 85 человек, включая контрольную группу), но при удачных испытаниях на большем числе пациентов метод может быть очень актуален для ранней диагностики рака.