Новый метод секвенирования микробиома позволяет идентифицировать отдельные штаммы

Американские ученые разработали Microbe-seq — высокопроизводительный метод секвенирования единичных микробных клеток. Каждая клетка заключается в отдельную каплю, где происходит лизис, амплификация и присоединение адаптеров и праймеров. Новый метод позволяет идентифицировать виды бактерий, которые сложно культивировать, и различать отдельные штаммы одного вида. 

Credit:
123rf.com

Микробиом разных людей может быть схож по видовому составу, но различается по тем штаммам, которые несет человек. Штаммы отличаются друг от друга значительно, как генетически, так и своими свойствами. Например, Escherichia coli может присутствовать в микробиоме здорового человека, но некоторые ее штаммы вызывают серьезные заболевания. Изучение микробиома на уровне штаммов — важная задача. Для ее решения исследователи из США создали новый метод высокопроизводительного секвенирования микробных геномов — Microbe-seq.

С помощью микрофлюидного устройства отдельные микробные клетки инкапсулируют в капли, содержащие лизирующие реагенты. После периода инкубации клетки лизируются, ДНК остается в каплях. Их сливают с другими каплями, содержащими реагенты для амплификации. Получившиеся большие капли инкубируют, пока идет амплификация ДНК, после чего сливают уже с третьими каплями, содержащими все необходимое для присоединения адаптеров. После присоединения адаптеров добавляют четвертые капли, содержащие гидрогелевые микросферы с ДНК-праймерами. Праймеры состоят из двух частей — одна комплементарна адаптеру, другая индивидуальна для каждой капли. После всего этого капли разбивают, добавляют адаптеры для секвенирования и секвенируют ДНК на приборах Illumina. Последовательности одной капли представляют собой единый амплифицированный геном (single-amplified genomes, SAG).

Метод проверили на сообществе микроорганизмов с известным составом; для этих микроорганизмов есть референсные геномы. Анализ показал, что каждый SAG представляет собой геном единственного микроорганизма.

Для очень многих компонентов микробиома референсных последовательностей нет. Авторы создали подход, который позволяет объединить прочтения от разных микроорганизмов одного вида и получить референсный геном. Сравнив индивидуальные микроорганизмы одного вида, можно идентифицировать отдельные штаммы.

После этого новый метод опробовали на семи образцах стула одного здорового донора. Каждый образец содержал от 1000 до 7000 SAG, всего 21 914 SAG. В каждом SAG было около 70 000 прочтений. Всего авторы идентифицировали 76 видов, многие из которых сложно культивировать. Исследователи отмечают, что грамотрицательные бактерии менее представлены, вероятно, из-за выбранного метода лизиса клеток. Также ученым удалось идентифицировать штаммы отдельных SAG, несмотря на то, что SAG покрывают только около 10% бактериального генома.

Геномы идентифицированных видов использовали, чтобы изучить горизонтальный перенос генов в микробиоме. Авторы выявили многочисленные случаи переноса генов между бактериями типа Bacteroidetes, в том числе генов системы секреции типа VI, опосредующей конкуренцию между штаммами. Кроме того, метод позволяет выявить генетический материал фагов для изучения взаимодействия фаг-хозяин не только на уровне видов, но и на уровне штаммов.

С помощью высокопроизводительного метода Microbe-seq ученые получили генетическую информацию о десятках тысяч индивидуальных микроорганизмах и собрали de novo геномы 76 видов, большую часть которых до этого не культивировали. Авторы продолжают совершенствовать свой метод, в частности, чтобы устранить неравномерную представленность грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Источник

Zheng W., et al. High-throughput, single-microbe genomics with strain resolution, applied to a human gut microbiome // Science, Vol 376, Issue 6597 (2022), published June 03, 2022, DOI: 10.1126/science.abm1483

Добавить в избранное

Вам будет интересно