Новый метод скрининга выявил наиболее эффективные модифицированные Т-клетки для иммунотерапии

Постоянная стимуляция T-клеток, экспрессирующих трансгенные T-клеточные рецепторы или химерные антигенные рецепторы (CAR), приводит к их истощению. Истощенные T-клетки хуже пролиферируют, меньше продуцируют цитокины и экспрессируют ингибиторные рецепторы. В ряде исследований предпринималась попытка создать устойчивые к истощению T-клетки — для этого их геном редактировали с помощью CRISPR-Cas. Ученые из США воспользовались CRISPR-опосредованным нокином, чтобы провести скрининг и выявить белки, нокин которых улучшает работу CAR-T-клеток.

Авторы исследования разработали платформу для масштабного скрининга, которую назвали ModPoKI (modular pooled knockin). Они собрали две библиотеки: одна содержала последовательности генов, кодирующих 100 транскрипционных факторов, другая — 129 генов поверхностных рецепторов. Исследователи оценивали не только одиночный нокин транскрипционных факторов, но и результат одновременного нокина их пар.

Последовательности снабжали адаптерами по концам и интегрировали в ген TRAC, кодирующий константную α-цепь T-клеточного рецептора. Ученые использовали многоцистронные адаптеры, содержащие функциональный модуль (траскрипционный фактор или поверхностный рецептор) и модуль специфичности (T-клеточный рецептор или CAR). Каждая из использованных последовательностей была снабжена двумя уникальными баркодами. Всего в такой системе существует более 37 миллионов различных комбинаций баркодов, позволяющих однозначно идентифицировать тот или иной генетический конструкт. Таким образом, система ModPoKI позволяет производить быстрый скрининг сотен T-клеточных конструктов.

Истощение Т-клеток авторы исследования изучали in vitro. Для этого они кокультивировали Т-лимфоциты с опухолевыми клетками, каждые 48 часов заменяя клетки-мишени на свежие. Анализ маркеров истощения подтвердил, что оно действительно происходило в условиях повторяющейся стимуляции опухолевыми антигенами. Убедившись в этом, ученые повторили эксперимент с клетками платформы ModPoKI, несущими нокины. Они установили, что нокин TFAP4 улучшает функционирование T-клеток. Скрининг пар транскрипционных факторов показал, что двойной нокин BATF-TFAP4 также положительно сказывался на состоянии Т-клеток и уменьшал их истощение при стимуляции — эта комбинация оказалась наиболее эффективной.

Эффективность нокина TFAP4 ученые подтвердили in vivo. В опытах на мышиной модели лейкоза они показали, что CAR-T с нокином TFAP4 эффективнее сдерживали прогрессию лейкоза и улучшали выживаемость модельных животных.

Интересно, что, хотя в большинстве случаев нокин генов одинаково сказывался как на T-клетках, несущих только T-клеточные рецепторы, так и на CAR-T клетках, авторы выявили несколько исключений из этого правила. Так, у конструкта PD-1/4-1BB в скринингах, проведенных на CAR-T клетках и клетках с Т-клеточными рецепторами, была противоположная кинетика.

Авторы работы также проверили, как различные вносимые конструкты влияют на истощаемость тех или иных вариантов CAR-T клеток. Они сравнили работу двух вариантов CAR, специфичных к CD19: один содержал внутриклеточный домен CD28z, другой — 4-1BB. На таких клетках ученые проводили нокин разных конструктов, содержащих 4-1BB. Результаты скрининга показали, что Т-клетки с комбинацией 4-1BB и CD28 функционировали эффективнее. Исследователи предполагают, что избыточный 4-1BB сигналинг мог негативно сказываться на их работе.

Затем исследователи подробнее изучили, как TFAP4 улучшает персистирование Т-клеток и каким образом этому способствует BATF — как уже говорилось выше, скрининг пар транскрипционных факторов указал на эффективность этого сочетания. Анализ транскриптома и изучение доступности хроматина с помощью ATAC-seq показали, что BATF облегчает перестройку транскрипции T-клетки, которой управляет TFAP4.

Разработанная платформа, таким образом, стала новым способом систематического изучения того, какие именно генетические модификации Т-лимфоцитов станут наиболее эффективны для дальнейшего улучшения CAR-T клеточной терапии.

Цитоплазматический «хвост» из CTLA-4 повышает эффективность CAR-T клеток