Новый протокол секвенирования РНК с использованием транспозазы Tn5

Разработан новый протокол для секвенирования РНК, в котором использование транспозазы Tn5 позволяет в один шаг фрагментировать гетеродуплекс РНК-ДНК и пришить адаптеры.

Изображение:

Димер транспозазы Tn5 связывает два конца ДНК

Credit: Wikipedia.org | CC 4.0

Секвенирование РНК широко используется для оценки транскрипции генов. На данный момент процедура эта довольно трудоемкая: с помощью обратной транскрипции и последующей репликации необходимо получить двухцепочечную ДНК, которую затем фрагментировать, амплифицировать и использовать для прочтения. Группа ученых из Китая и Америки показала, что применение транспозазы Tn5 существенно упрощает этот процесс.

Бактериальная транспозаза  Tn5 — белок, который отвечает за перемещение в геномах бактерий одноименного транспозона, содержащего гены антибиотикорезистентности. Tn5 случайным образом связывается с двунитевой ДНК и разрезает ее. Однако оказалось, что она также способна работать и с гетеродуплексом ДНК-РНК, который образуется после обратной транскрипции, и сразу пришивать к РНК адаптеры для секвенирования. Таким образом, она позволяет пропустить один из шагов в протоколе — этап двухцепочечной ДНК.

Метод, который авторы назвали SHERRY (Sequencing HEteRo RNA-DNA-hYbrid), оказался достаточно универсальным — в качестве исходного материала можно использовать как РНК образца ткани, так и единичные клетки.

Кроме того, ученые провели сравнение этого метода с широко используемыми протоколами Smart-seq2 для секвенирования транскриптома единичных клеток и NEBNext для секвенирования РНК, выделенных из образца ткани. Результаты SHERRY в обоих случаях были сопоставимы с полученными традиционными методиками, однако новые метод оказался намного менее трудозатратным и как минимум вдвое более быстрым — 5 шагов занимают всего 4 часа, при этом только 30 минут требуется участие человека. Кроме того, новый метод выгоден и с финансовой точки зрения — реактивы для него существенно дешевле, чем для Smart-seq2 и NEBNext.

Тем не менее исследователи отмечают ограничения использования SHERRY, связанные с неравномерностью транскрипционного покрытия. Так как этот прием использует обратную транскрипцию еще не фрагментированной РНК, существует вероятность, что обратная транскриптаза просто не дойдет до конца молекулы. Следовательно, покрытие у 3’-конца окажется выше. Эта ситуация была несколько улучшена добавлением олигопраймеров-переключателей, которые ученые добавили к смеси для обратной транскрипции, чтобы прошла преамплификация, наподобие протокола Smart-seq2. Авторы также отмечают, что для улучшения работы SHERRY необходима его дальнейшая оптимизация.

Таким образом, новый протокол с использованием Tn5 для секвенирования РНК показал себя простым, быстрым, дешевым и достаточно эффективным. Однако при работе с ним также стоит учитывать его особенности.

Источник

Lin Di, et. al.// RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids. // Proceedings of the National Academy of Sciences, 2020, 201919800; DOI:  10.1073/pnas.1919800117

Добавить в избранное

Вам будет интересно