Новый регулятор опухолевой супрессии — PADI4

Группа под руководством исследователей из Института Вистар (США) узнала новые подробности о том, как р53 подавляет развитие опухолей, изучая один из гипоморфных вариантов его гена. Транскрипционный фактор p53, регулирующий клеточный цикл, активируется при повреждениях ДНК и других неблагоприятных факторах и останавливает клеточный цикл и репликацию. Мутации в гене TP53 приводят к развитию онкозаболеваний, как за счет потери функции p53, так и за счет приобретения им онкогенных функций.

В США примерно у 4,5 миллиона человек есть унаследованные мутации в p53, увеличивающие риск развития рака. Небольшая подгруппа этих людей имеет полностью инактивирующие p53 мутации, ассоциированные с синдромом Ли Фраумени, для которого характерно раннее развитие множественных типов рака. Известно более 200 наследуемых вариантов белка TP53; некоторые из них являются гипоморфными (белок действует слабее, чем белок дикого типа, но в том же направлении). У людей с такими мутациями также есть предрасположенность к онкозаболеваниям, но они менее агрессивны и развиваются позже.

Исследователи выбрали специфичный для лиц африканского происхождения гипоморфный вариант, вызывающий в белке замену Y107H (тирозин на гистидин в позиции 107), поскольку афроамериканцы имеют самое большое бремя рака среди всех этнических групп в мире. Целью ученых было, во-первых, выяснить, как влияет эта замена на активность белка, во-вторых, определить, какие препараты могут быть эффективны при такой замене.

Эксперименты на клеточных линиях подтвердили, что эта мутация снижает способность р53 подавлять пролиферацию. При этом, когда ученые сравнили лимфобластоидные клетки человека (LCL) двух типов — с p53 дикого типа (WT p53) и гетерозиготные по варианту Y107H,  — препарат доксорубицин, повреждающий ДНК, вызвал более сильный апоптоз у LCL Y107H по сравнению с WT p53, а также с клетками, имеющими мутацию R273H, которая ассоциирована с синдромом Ли Фраументи.

Используя редактирование CRISPR-Cas9, авторы создали мышь с мутацией Y107H, провели ее скрещивание с мышами без мутаций и исследовали эмбриональные фибробласты потомков. Фибробласты, несущие мутацию, также обладали несколько повышенной чувствительностью к доксорубицину по сравнению с диким типом или нефункциональным р53. Затем ученые оценили реакцию мышей Y107H на повреждение ДНК, вызванное гамма-облучением: в селезенке и тимусе у них был повышен апоптоз по сравнению с диким типом. Исследователи обнаружили повышенную пролиферацию и сниженную способность к остановке роста в культурах LCL и эмбриональных фибробластов, что может объяснить повышенный апоптоз на фоне доксорубицина или гамма-излучения: ранее была обнаружена корреляция между пролиферацией и р53-опосредованным апоптозом.

Затем авторы провели РНК-секвенирование человеческих LCL дикого типа и гетерозиготных по Y107H, чтобы выяснить, как мутация изменяет набор генов-мишеней р53, активируемых в ответ на препараты нутлин или цисплатин. Обнаружилось небольшое подмножество генов, активация которых нарушается заменой Y107H. Среди этих генов оказался PADI4. Дополнительный анализ двух других гипоморфов p53 (P47S и G334R) показал, что активация PADI4 нарушена во всех трех гипоморфных клеточных линиях. Продукт этого гена — эпигенетический модификатор PADI4, который превращает аргинин в цитруллин.

Авторы установили с помощью хроматин-иммунопреципитации (ChIP-qPCR), что замена Y107H влияет на способность р53 связывать ДНК, хотя in vivo выраженность этого дефекта отчасти компенсируется. Структурные исследования подтвердили, что белок с заменой склонен к укладке в неправильную конформацию.

Способность варианта Y107H подавлять опухоль in vivo была существенно снижена: более чем у трети мышей, гомозиготных по Y107H, спонтанно развивались опухоли, в том числе те виды, которые у людей часто бывают связаны с синдромом Ли Фраумени, — саркома, адренокортикальная карцинома и рак молочной железы.

Затем авторы работы сосредоточились на гене PADI4 — основной мишени p53, взаимодействие с которой нарушает Y107H. Этот ген отвечал за повышенную эффективность ингибиторов глутаминазы против опухолей с гипоморфами р53. Его продукт, очевидно, напрямую взаимодействует с р53 и повышает его стабильность.

Авторы создали клеточные клоны, трансфицированные PADI4, и убедились, что сверхэкспрессия PADI4 снижает пролиферацию в этих клонах и замедляет рост опухоли при введении таких клеток мыши под кожу. Ученые также обнаружили, что активация PADI4 например, с помощью CRISPR, подавляет рост опухоли, в меньшей степени при сайленсинге p53. Следовательно, PADI4 обладает как р53-зависимой, так и р53-независимой супрессорной функцией.

Поскольку повышенная экспрессия PADI4, очевидно, активирует пути, связанные с противоопухолевым иммунитетом, исследователи проверили роль иммунной системы в PADI4-опосредованном подавлении опухоли. Они проанализировали данные по 60 000 опухолям в базе данных TCGA и идентифицировали гены-мишени p53, которые демонстрируют нарушенную активацию в клетках Y107H и коэкспрессируются с PADI4 при различных типах рака. В итоге было обнаружено, что высокая экспрессия пяти генов — PADI4, CEACAM21, IL16, S1PR4, IL21R — в значительной степени связана с улучшением выживаемости при множественных типах рака. Средняя экспрессия этих пяти генов также ассоциирована с повышенной инфильтрацией CD8+ Т-клеток в меланомы и предсказывает более длительную выживаемость при меланоме после лечения ингибиторами иммунных контрольных точек.

Таким образом, авторы обнаружили новый ген, способный подавлять развитие опухоли, связанный с р53 и влияющий на иммунный ответ.

«По сути, когда опухолевая клетка делится на две, а этого не должно быть, p53 встревожен, он включает PADI4, а PADI4 говорит: “Иммунная система, вам лучше прийти за мной”», — объясняет руководитель работы Морин Мерфи. «Мы не только сказали, что у нас есть важный ген-мишень p53, но у нас также есть важная сигнатура из пяти генов, которая на самом деле скажет нам, кто будет реагировать на иммунотерапию, а кто нет, и р53 — основа этой сигнатуры», — добавила она.

Как онкосупрессор p53 стабилизирует геном