Как онкосупрессор p53 стабилизирует геном

В процессе деления клетки особенно уязвимы, поскольку при митозе ДНК копируется быстро, что повышает риск возникновения мутаций. В частности, их стимулируют сдвиги цепочки, служащей матрицей для синтеза новой ДНК. Именно поэтому при дупликации ДНК ее транскрипция должна быть остановлена — в случае, если транскрипция продолжится, могут возникнуть серьезные нарушения и даже мутации, приводящие к раку.

За регуляцию этих процессов в клетке отвечает, в частности, онкосупрессор p53, знаменитый «страж генома». Это транскрипционный фактор, который подавляет образование опухолей. Поэтому кодирующий его ген TP53 относится к онкогенам — его мутации встречаются в каждой второй опухоли. При этом механизмы защиты генома от нестабильности супрессором p53 сложны и не до конца изучены.

Авторы новой статьи в Cell Reports, исследователи из Италии и Германии, предположили существование взаимосвязи между метаболизмом с участием p53 и эпигенетической регуляцией конститутивного гетерохроматина — то есть с упаковкой ДНК и ее переходом в неактивное состояние. Авторы полагают, что именно эпигенетические модификации лежат в основе механизма работы p53.

Имеющее ключевое значение для эпигенетической регуляции метилирование ДНК сильно зависит от цикла метионина — метаболического пути, который обеспечивает синтез S-аденозилметионина (SAM) — универсального донора метильных групп. На концентрацию этого важного кофермента, в свою очередь, влияет состояние хроматина, хотя метаболизм SAM регулируется и за счет других специфических механизмов. Именно поэтому новая статья подробно описывает связь функционирования p53 с концентрацией SAM.

Проведенный авторами иммуногистохимический анализ тканевых матриц (tissue microarray, TMA) на основе нормальных клеток и клеток рака протоков поджелудочной железы (pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC) указал, что малигнизация сопровождается снижением уровня SAM. Его концентрация также оказалась обратно пропорциональной частоте мутаций в гене TP53.

Для выявления причинно-следственной связи между p53 и SAM авторы использовали панель мышиных клеток PDAC. Были получены линии с экспрессией онкогена Kras, с нокаутированным либо инактивированным (с помощью индуцируемой доксициклином shRNA) геном TP53, а также с мутацией в этом гене. Также в статье были проанализированы ранее опубликованные наборы данных, характеризующие клетки пациентов с раком поджелудочной железы.

Авторы предположили, что изменения содержания SAM в клетке нарушают функционирование p53 и определяют чувствительность клеток к изменениям в метилировании ДНК. Они подвергли мышиные клетки PDAC действию децитабина (dC) — аналога цитидина, подавляющего метилирование. С помощью дифференциального флуоресцентного окрашивания, анализа фаз клеточного цикла и исследования хромосомных аберраций было показано, что нарушения клеточного цикла возникают только у клеток, лишенных функционального p53.

Для того, чтобы выяснить механизмы возникновения хромосомных аберраций, исследователи применили анализ состояния волокон ДНК (DNA fiber assay), который позволяет отслеживать изменения ДНК в ходе репликации. Оказалось, что при обработке dC клеток без p53 число остановленных вилок репликации увеличивается. Более того, в них накапливаются двухцепочечные разрывы, что определяет фрагментацию хромосом.

Известно, что репликационный стресс и разрывы в ДНК связаны с накоплением избыточных R-петель. Они препятствуют репликации, поскольку этот процесс конкурирует с транскрипцией ДНК. Авторы подтвердили накоплением R-петель с помощью специфических антител к ним и иммунофлюоресцентного анализа.

R-петли часто наблюдаются в областях повторов ДНК, связаны с нарушением H3K9me3-метилирования и с геномной нестабильностью у целого ряда модельных организмов. В новой работе с помощью конфокальной микроскопии и дот-блоттинга было показано, что сайленсинг наиболее значимых РНК-сателлитных областей за счет трансфекции клеток LNA (antago-major satellite (MajSat), технология антисмысловой Locked DNA) снижает число R-петель.

С помощью той же методологии авторы напрямую подтвердили связь активности сателлитных РНК, вызванного ими накопления R-петель и потери генетической стабильности в масштабах целого генома.

Описанные нарушения функционирования клетки при утрате p53 опосредованы именно уровнем SAM, поскольку введение экзогенного кофермента подавляет активность сателлитов. В результате клетка вновь оказывается способной регулировать состояние своего генома.

В основе данного феномена — регуляция онкосупрессором p53 транскрипции генов одноуглеродного метаболизма, в том числе Slc43a2. Этот ген кодирует транспортер метионина, играющий ключевую роль в синтезе SAM.

Таким образом, авторы показали, что онкосупрессор p53 поддерживает стабильное состояние генома, обеспечивая нужные концентрации SAM. В лишенных p53 клетках нарушается метилирование ДНК, что снижает уровень репрессии хроматина, приводит к значительному подавлению метилирования остатков лизина гистонов H3K9. В результате усиливается активность сателлитных РНК и возникает связанный с образованием R-петель репликационный стресс, а также хромосомные аберрации.

«Страж генома» p53 участвует в восстановлении повреждения эпителия