Новый тест обнаруживает возбудителя туляремии с помощью LAMP

Туляремия — зооантропонозная природно-очаговая инфекция, симптомы которой включают интоксикацию, лихорадку и поражение лимфатических узлов. Для выявления возбудителя туляремии, Francisella tularensis, в России доступны несколько наборов на основе ПЦР и один иммунохроматографический тест. ПЦР-наборы высокочувствительны и специфичны, однако требуют наличия дорогостоящего оборудования, навыков у персонала и времени. Иммунохроматографический тест прост в использовании и требует всего 15 минут для проведения, но имеет низкую чувствительность. Реакция петлевой изотермической амплификации (loop isothermal amplification, LAMP) находит все большее применение для идентификации патогенов, так как занимает от 15 до 60 минут, имеет высокую чувствительность и специфичность, но не требует сложного дорогостоящего оборудования. Российские ученые из Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора в Оболенске разработали метод на основе LAMP для выявления туляремийного микроба.

Исследователи использовали штаммы F. tularensis, включая один вакцинный, девять патогенных, относящихся к эпидемически значимым подвидам микроба, и шесть штаммов, выделенных на территории Ханты-Мансийского автономного округа и Дальнего Востока. Для проверки специфичности метода они выбрали 12 штаммов возбудителей чумы, псевдотуберкулеза, бруцеллеза, легионеллеза, сибирской язвы, холеры, а также кишечной палочки. Реакцию амплификации проводили при температуре 63 °С в течение 60 минут (без петлевых праймеров) или 30 минут (с петлевыми праймерами) в присутствии термостабильной SD-полимеразы.

В качестве мишеней для нового теста ученые выбрали три гена F. tularensis – acpA, кодирующий кислую фосфатазу, fopA, кодирующий белок внешней мембраны, и участок гена iglC острова патогенности возбудителя. Для каждой такой мишени они сконструировали по два набора праймеров и проверили их специфичность. Оба набора праймеров на основе гена кислой фосфатазы обладали хорошей способностью выявлять все эпидемически значимые подвиды туляремийного микроба, однако один из них давал положительную реакцию со штаммами бруцелл. Наборы праймеров на основе гена белка внешней мембраны детектировали все тестируемые подвиды F. tularensis и не давали положительных реакций с ДНК других возбудителей. Один из комплектов праймеров на основе участка гена iglC реагировал со штаммами легионелл. К наиболее удачным наборам ученые сконструировали петлевые праймеры, что позволило сократить время проведения анализа. Наиболее перспективными для дальнейшей работы оказались три набора праймеров, обозначенные как acpFt101, fopFt132 и iglCFt1.

На следующем этапе работы ученые адаптировали методику к использованию интеркалирующего красителя SYTO 82 для детекции сигнала, заменив электрофорез с применением бромистого этидия. Это позволило осуществлять регистрацию сигнала непосредственно после завершения реакции визуально с помощью ультрафиолетового анализатора (например, трансиллюминатора), еще больше сократив время проведения анализа.

Далее разработчики проверили чувствительность метода с использованием ДНК вакцинного штамма F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ. Они приготовили ряд десятикратных разведений и определили, что предел чувствительности составил 5 пг ДНК для наборов acpFt101 и fopFt132 и 500 фг для iglCFt1. При этом введение петлевых праймеров не повлияло на чувствительность детекции.

Таким образом, создан удобный в применении и не требующий сложного оборудования тест для клинической и полевой диагностики возбудителя туляремии на основе LAMP. Он позволил сократить время анализа в два раза за счет введения петлевых праймеров и визуальной детекции сигнала с применением интеркалирующего красителя SYTO 82.