Нуклеаза Cas9 увеличивает глубину покрытия при нанопоровом секвенировании

Ученые из США совместно с сотрудниками Oxford Nanopore Technologies разработали новый метод таргетного нанопорового секвенирования с использованием нуклеазы Cas9 и назвали его nCATS — nanopore Cas9-targeted sequencing. Метод разработан для обогащения мишени в образце и, таким образом, позволяет увеличить глубину покрытия. Это важно при изучении паттернов метилирования и частоты мутаций в гетерогенных клинических образцах.

Образец перед секвенированием обогащают с помощью рибонуклеопротеинового комплекса активной Cas9 с гидовой РНК (RNP). Сначала мишень фланкируется этим RNP, затем свободные концы ДНК дефосфорилируются, и поэтому на них уже не может «сесть» адаптер. Затем нуклеаза Cas9 вносит двунитевые разрывы по концам мишени, которые остаются фосфорилированными, и по этой причине адаптеры приоритетно лигируются с ними. Затем образец загружается в нанопоровый секвенатор.

Первые эксперименты проводились на хорошо охарактеризованной линии человеческих лимфобластов GM12878 и трех клеточных линиях рака молочной железы: MCF10A, MCF-7 и MDA-MB-231. Ученые создали панель из 10 сайтов размером от 12 до 24 тысяч пар оснований (т. п. о.). Для оценки однонуклеотидных замен были выбраны три гена, ассоциированных с раком (TP53, KRAS и BRAF). Паттерны CpG-метилирования изучались в пяти областях (KRT19, SLC12A4, GSTP1, TPM2 и GPX1). Для определения структурных вариантов ученые выбрали две предполагаемые большие делеции (6–8 т. п. о.), основываясь на предыдущих исследованиях. В некоторые циклы секвенирования также был включен локус BRCA1 для оценки применимости метода к анализу длинных фрагментов (более 80 т. п. о.) и повторяющихся участков.

Для подготовки библиотек необходимо 3 мкг исходной ДНК. Нанопоровое секвенирование проводили с использованием проточных ячеек MinION и Flongle. Авторы отмечают, что выгоднее использовать комбинацию множества гидовых РНК для каждого фланка локуса, чем по одной, так как это обеспечивает значительно более глубокое покрытие. Для MinION оно было в среднем 680-кратным, для Flongle — 34-кратным.

Нанопоровое секвенирование дает относительно высокий процент ошибок, поэтому авторы разработали компьютерный алгоритм, позволяющий с высокой точностью определять генетические варианты в полученных данных с отсечением ложноположительных результатов.

После валидации ученые успешно применили nCATS для образцов нормальной ткани молочной железы, мышиной ксенографтной модели рака и гетерогенного образца ткани от пациента.