Обратная транскриптаза защищает бактерию от фагов, формируя новый ген

Мобильные генетические элементы: вирусы, плазмиды, транспозоны, двигают эволюцию геномов, экспрессируя ферменты, которые «перетасовывают» ДНК. Напротив, у клетки есть система защиты от распространения мобильных элементов. Иногда средства для борьбы дают сами мобильные элементы. У бактерий экстракция генов, кодируемых транспозонами, дала начало системе CRISPR-Cas. Исследователи из США изучили дополнительные системы защиты, которые использует бактерия при встрече с бактериофагами. Обычно бактерии находят и уничтожают чужие нуклеиновые кислоты нуклеазами. Но оказывается, есть и другие системы, в состав которых входят обратные транскриптазы (RT), а иммунитет обеспечивает синтез нуклеиновых кислот.

Прокариотические RT, по-видимому, произошли от единого предка-ретроэлемента. Существует несколько классов «одомашненных» ретроэлементов, защищающих клетку от фагов. Например, ретроны содержат сложные опероны, состоящие из RT, некодирующей РНК (нкРНК) и токсинов. Пока нет инфекции, RT транскрибирует нкРНК с образованием комплементарной ДНК, которая поддерживает токсины в неактивном состоянии. При инфекции токсины активируются, и клетка погибает.

Системы ассоциированных с защитой обратных транскриптаз (DRT1–9) обладают противовирусной активностью, однако до недавнего времени их субстраты и механизмы, лежащие в основе противовирусного действия, были неизвестны. В отличие от ретронов, у системы DRT есть только один оперон. Так что, предположительно, RT защищает клетку от фагов самостоятельно. Авторы использовали систематический подход для выявления кДНК-продуктов, которые были синтезированы DRT2, и выяснили, как DRT связаны с защитой от вирусов.

Ученые выбрали DRT2 из-за их очень простого строения: в состав системы DRT2 входит одна открытая рамка считывания и вышестоящая нкРНК. RT в составе DRT2 содержит единственный домен — предполагаемую РНК-зависимую ДНК-полимеразу — и не кодирует никаких вспомогательных доменов. Авторы работы предположили, что в случае DRT2 транскрибируемый продукт кДНК играет ключевую роль в защите от вирусов.

Для того, чтобы идентифицировать эту кДНК, ученые использовали два метода. Первый метод предполагает слияние кДНК, синтезированных RT, с FLAG-тэгом, и ее иммунопреципитацию (cDIP-seq). Второй метод включает РНК-иммунопреципитацию, через которую выделяли РНК-субстраты, связанные с RT (RIP-seq). С помощью этих методов «обратной транскриптомики» авторы работы выделили молекулы РНК и кДНК, связанные с RT. Они использовали Klebsiella pneumoniae, в которой система DRT2, состоящая из RT и нкРНК, находилась на плазмиде под их нативными промоторами. С помощью последующего геномного анализа было показано, что большинство из найденных РНК и кДНК относятся к локусу нкРНК, иными словами, система DRT2, как и ретроны, кодирует собственный субстрат — нкРНК. Более того, даже при заражении фагом субстрат системы DRT2 не меняется.

Далее было установлено, что в составе нкРНК есть несколько консервативных шпилек (SL), матричный участок, соответствующий считанной с него кДНК, и длинный 3’-концевой участок, который, вероятно, служит для посадки RT. При заражении клеток клебсиеллы фагом T5 количество молекул кДНК резко увеличивалось, причем в отсутствие вируса кДНК пребывала в одноцепочечной форме, комплементарной нкРНК, а при заражении появлялась ее обратная комплементарная копия. Ученые заключили, что это обусловлено наличием у обратной транскриптазы еще и активности ДНК-зависимой ДНК-полимеразы.

Чтобы разобраться в противовирусном механизме DRT2, авторы работы последовательно вводили мутации SL в составе нкРНК и показали, что делеции некоторых из них достаточно, чтобы лишить систему защитных свойств. Одна из этих шпилек, SL2, примыкает к матричному участку в составе нкРНК и, как предположили авторы, может играть роль в инициации или терминации синтеза кДНК. С помощью cDIP-seq было установлено, что с нкРНК считывается не одна кДНК, а конкатемерная кДНК (ccDNA), то есть включающая несколько идущих друг за другом повторов последовательностей кДНК. Образование таких молекул возможно при обратной транскрипции по типу катящегося кольца, когда RT постоянно возвращается в точку старта и синтезирует еще одну последовательность кДНК. В этом случае ccDNA синтезируется как одноцепочечная ДНК, которая переводится в двуцепочечную форму RT. Длины ccDNA варьируют от 1 до 40 копий, поэтому возможно множество актов обратной транскрипции. Вирусная инфекция увеличивает образование ccDNA в 10000 раз, что указывает на противовирусные свойства конкатемера.

В составе конкатемеров ученые нашли открытые рамки считывания, причем при прочтении с одной из них на пути полимеразы не возникает стоп-кодон. Авторы предположили, что конкатемерная РНК может кодировать противовирусный полипептид. Авторы заключили, что обратная транскрипция по типу катящегося кольца в DRT2 приводит к образованию криптического гена. Этот ген авторы работы обозначили как neo (nearly endless ORF).

С гена neo считываются пептиды, заставляющие зараженную вирусом клетку войти в состояние покоя. Интересно, что белки Neo по аминокислотной последовательности стоят особняком, потому что не содержат известных функциональных доменов, однако на структурном уровне имеют достоверно предсказываемые α-спирали.

Наконец, биоинформатический анализ показал, что обратная транскрипция по типу катящегося кольца, Neo и связанная с ним система противовирусной защиты, основанная на уходе клетки в состояние покоя, существует и у многих других бактерий.