Партеногенетическая мышь дала потомство

Часть генов млекопитающих подвергается импринтингу — эпигенетической регуляции, при которой экспрессируется только один из унаследованных аллеей. Экспрессия аллеля зависит от того, какой родитель его передал. Именно поэтому партеногенез у млекопитающих маловероятен. Импринтинг происходит за счет метилирования ДНК в промоторах. Метилирование блокирует экспрессию гена, полученного от одного из родителей.

Ученые ищут способы обойти этот механизм. В 2004 году команда из Японии создала мышь из двух яйцеклеток разных генетически модифицированных самок. Одну из яйцеклеток отредактировали так, чтобы она имела генетическое сходство со сперматозоидом. Полученная после слияния яйцеклеток самка мыши выжила и родила потомство.

В новой работе три исследователя из Китая использовали CRISPR-систему для целенаправленного переписывания метилирования ДНК в семи контрольных областях импринтинга (imprinting control regions, ICR), чтобы сделать возможным развитие эмбриона из единственной неоплодотворенной яйцеклетки мыши.

Ученые обратили внимание на метилированные ICR, которые играют решающую роль в развитии эмбриона и плода. Отцовские заметилированные ICR располагались в генах H19 и Gtl2, материнские — в генах Igf2r, Snrpn, Kcnq1ot1, Nespas и Peg10.

В работе использовались мыши линии B6CASTF1. Эти мыши несут однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), которые можно использовать для направления CRISPR-системы. В ооцит вводили мРНК, кодирующую dCas9-Dnmt3a или dCpf1-Tet1, и гидовые РНК, нацеленные на ICR. Конструкция dCas9-Dnmt3a представляет собой каталитически неактивную нуклеазу Cas9, сшитую с метилтрансферазой. Такая химера вносила новые метильные группы в участки-мишени и была нацелена на материнские аллели. Конструкция dCpf1-Tet1 — это неактивная нуклеаза Cpf1, соединенная с ферментом, обеспечивающим таргетное de novo деметилирование. С ее помощью деметилировали отцовские аллели.

Сначала ученые протестировали dCas9-Dnmt3a и dCpf1-Tet1 по отдельности. В эмбрионах, полученных из яйцеклеток с заметилированными отцовскими или материнскими ICR, названными выше, паттерн метилирования поддерживался во всех клетках, однако такие эмбрионы не были жизнеспособны.

Тогда ученые применили dCas9-Dnmt3a и dCpf1-Tet1 одновременно и модифицировали все семь важных участков. Для успешного результата ученым потребовалось довольно много яйцеклеток. Они создали 389 модифицированных эмбрионов, 227 из которых были предположительно партеногенетическими диплоидными эмбрионами на стадии одной клетки. Из них 192 эмбриона in vitro развились до стадии бластоцисты и были имплантированы самкам мышей. В итоге родились три живых мышонка. Двое погибли в течение 24 часов и только один выжил.

Бисульфитное секвенирование ткани хвоста показало, что все отредактированные ICR заметилированы как надо. Напротив, у погибших мышат наблюдалась потеря метилирования как минимум в одной ICR, что говорит о важной роли каждой из семи областей.

В возрасте 16 недель выжившую мышь скрестили с самцом и получили потомство, что говорит о нормальной репродуктивной функции.

«Это довольно круто, но в том, что мы узнали о работе размножения и генетическом контроле за ним, нет ничего неожиданного, — комментирует Луи Лефевр, молекулярный биолог из Университета Британской Колумбии (Канада), не принимавший участия в исследовании. — В некотором смысле это подвиг, так как ученым пришлось немало потрудиться, чтобы добиться успеха».

Авторы работы отмечают, что эффективность создания партеногенетических мышей была очень низкой. Возможно, не все важные ICR были учтены. Дальнейшая оптимизация систем редактирования позволит увеличить количество живых особей. Кроме того, необходимы дальнейшие исследования для оценки нецелевой активности систем. Тем не менее, работа открывает новые возможности в сельском хозяйстве и медицине.