Причина мутаций при меланоме — дезаминирование цитозина под действием ультрафиолета

Ученые из США показали, что солнечный свет вызывает определенные мутации ДНК, которые встречаются с высокой частотой при меланомах. Многие онкозаболевания, вызванные воздействиями окружающей среды, демонстрируют характерные мутационные сигнатуры. Например, для связанного с курением рака легких это мутации C/G в A/T. Большинство меланом и немеланомных видов рака кожи связаны с воздействием ультрафиолетовой части спектра солнечного света (ультрафиолет B, 280‑315 нм). При этом большая часть секвенированных геномов меланомы содержат замены цитозин→тимин (C→T) в дипиримидиновых последовательностях (например, TC или CC), анаиболее частый тип повреждений, возникающих под воздействием УФ-В, — цис-син-циклобутановые пиримидиновые димеры (CPD). Подобные премутации могут накапливаться со временем и приводить к возникновению рака.

Механизм преобразования CPD в характерные для меланомы замены цитозина на тимин неизвестен. Для его объяснения предлагается две модели. Согласно одной из них, ДНК-полимеразы при встрече с CPD включают в новую цепь аденин вместо цитозина. Конкурирующая модель предполагает, что цитозин в составе CPD очень восприимчив к гидролитическому дезаминированию, в результате которого образуются CPD, содержащие урацил. ДНК-полимераза включает в новую цепь комплементарный аденин, в следующем цикле репликации — комплементарный аденину тимин. В таком случае причиной мутации цитозин→тимин является реакция дезаминирования цитозина, а не ошибка полимеразы.

Авторы решили изучить повреждения ДНК под действием ультрафиолета, чтобы установить, может ли дезаминирование CPD быть связано с частыми мутациями C→T при меланоме. Для этого они создали новый метод секвенирования — circle-damage-seq, который позволяет картировать CPD, возникшие под действием ультрафиолета, в геноме человеческой клетки и при этом отличать дезаминированные CPD.

Метод circle-damage-seq основан на действии специфических ферментов репарации повреждений ДНК. После облучения клеток ультрафиолетом из них выделяли ДНК и обрабатывали ее ультразвуком до получения фрагментов размером 300–400 п.о., которые закольцовывали с помощью Т4 ДНК-лигазы. Затем ферменты репарации и S1-нуклеаза создавали двухцепочечные разрывы с потерей одного нуклеотида в местах, где были повреждения ДНК. Молекулы, не содержащие повреждений, оставались замкнутыми, что способствовало обогащению библиотеки. Разорванные молекулы амплифицировали с помощью ПЦР и определяли концевые последовательности методом секвенирования парных прочтений — то есть получали сиквенс участка, в котором находилось повреждение.

В фибробластах кожи человека, подвергнутых УФ-облучению, авторы обнаружили тетрануклеотидную консенсусную последовательность, где образуются CPD. Однако эта последовательность сама по себе не демонстрировала хорошего совпадения с известными мутациями C→T в геномах меланомы. Зато распределение дезаминированных CPD полностью совпало с распределением C→T замен. Это подтвердило, что ведущую роль в мутагенезе при меланоме играет дезаминирование. Клетки кожи делятся медленно, и времени для этого процесса у них достаточно.

Дальнейшее изучение механизмов возникновения мутаций позволит найти новые подходы к профилактике и лечению рака кожи. Поскольку дезаминирование цитозина в CPD — чисто химическая реакция, ее будет трудно предотвратить, отмечают авторы. Но удаление CPD с помощью ферментов репарации, проникающих в кожу, представляется разумной концепцией.