Продукцию антибактериального белка повысили с помощью новой экспрессионной системы

Ученые из ИБФМ им. Скрябина разработали гомологичную систему экспрессии для бета-литической протеазы бактерии Lysobacter capsici и рассказали об этом в International Journal of Molecular Sciences.

Внеклеточную бета-литическую протеазу (Blp) производят некоторые представители рода Lysobacter. Она относится к классу бактериолитических протеаз, расщепляющих пептидные связи в пептидных субъединицах основного компонента клеточной стенки бактерий — пептидогликана. Blp могла бы лечь в основу антибактериальных препаратов, однако до сих пор не существовало эффективной системы ее экспрессии. Это связано с токсичностью фермента и отсутствием секреторных путей в используемых штаммах-продуцентах. По мнению авторов новой работы, лучшее решение проблемы — создание гомологичной экспрессионной системы. Наработка Blp в биотехнологически значимых количествах должна происходить в «родном» штамме. Ученые выбрали штамм L. capsici VKM B-2533^T.

Ключевой элемент эффективной экспрессионной системы — сильный промотор. К настоящему времени описано не так много промоторов бактерий рода Lysobacter. Ученые сравнивали промотор GroEL бактерии Lysobacter enzymogenes, его модифицированную версию GroEL(A) и промотор бактериофага T5, ранее не тестировавшийся в лизобактере. В качестве маркера эффективности использовали GFP. Основой конструкции послужила плазмида pBBR1-MCS5 — на сегодня это единственная плазмида, которая поддерживается в клетках Lysobacter. Работу промотора оценивали по флуоресценции клеток L. capsici. Лучше всего ген gfp экспрессировался под контролем промотора T5. Интенсивность флуоресценции с GroEL(A) была в 13 раз ниже, но оба промотора значительно превосходили немодифицированный GroEL.

Для дальнейшей работы были выбраны GroEL(A) и T5. Ученые создали новые конструкты, в которых под эти промоторы был встроен ген blp, и получили два экспрессионных штамма L. capsici. Штаммы культивировали в течение 20 часов, а затем оценивали бактериолитическую активность культуральной жидкости против золотистого стафилококка в сравнении с таковой для штамма дикого типа. Кроме того, с помощью ОТ-ПЦР анализировали уровень экспрессии blp.

Оказалось, что конструкция с T5 повышает антибактериальную активность L. capsici в 3,86 раза, с GroEL(A) — в 3,02 раза. Экспрессия blp увеличилась в 667 и 246 раз, соответственно. Продукция белка Blp также выросла с 2,061 мг/л культуры для штамма дикого типа до 13,755 мг/л у экспрессионного штамма с GroEL(A) и 17,519 мг/л у штамма, трансформированного конструкцией с T5. Основываясь на этих результатах, ученые сделали вывод, что обе экспрессионные системы можно считать успешными. Дальнейшие исследования выявили снижение экспрессии и секреции многих остальных белков в штаммах-продуцентах Blp. Это повышает ценность разработанных экспрессионных систем, так как упрощает очистку целевого белка.

На следующем этапе ученые перенесли одну из экспрессионных систем из лаборатории в условия, приближенные к промышленным, чтобы оценить возможность масштабирования производства Blp. Они выбрали штамм с конструкцией, содержащей промотор T5 (L. capsici PT5-blp). Ранее в лаборатории, в которой работает эта команда, была разработана среда RM, оптимальная для культивирования лизобактера в ферментерах. Эксперименты проводились с ней. Штамм вел себя стабильно в 10-литровом ферментере. Бактериолитическая активность культуральной жидкости росла вместе с оптической плотностью культуры и достигала максимума через 30 часов. Выход белка составил 43,991 мг/л.

В финале работы ученые показали, что гомологичную экспрессионную систему можно использовать и для других белков L. capsici.

На вопросы PCR.NEWS отвечает первый автор работы Ирина Кудрякова, к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории биохимии клеточной поверхности микроорганизмов ИБФМ РАН:

Планируете ли вы разработку гомологичных экспрессионных систем для других лизобактеров?

Да, в настоящее время активно ведутся работы по разработке экспрессионной системы на основе перспективных штаммов Lysobacter sp. XL1 и L. gummosus 10.1.1, обладающих, как и L. capsici VKM B-2533T, мощной литической активностью.

Есть ли в планах использование экспрессионной системы для других белков не в качестве доказательства концепции, как в последнем эксперименте, а с прицелом на производство, как для Blp?

Да, есть. Полученная в представленной работе гомологичная система экспрессии на основе L. capsici VKM B-2533^T открывает перед нами огромные горизонты для работы с бактериолитическими ферментами Lysobacter. Одна из главных задач нашей лаборатории — разработка антимикробных препаратов нового поколения на основе бактериолитических ферментов. Мы с использованием различных подходов ведем поиск перспективных литических ферментов из разных штаммов Lysobacter. Для их выделения будет использоваться, безусловно, гомологичная система экспрессии.

Культивирование L. capsici PT5-blp в ферментере АНКУМ-2М. Credit: Ирина Кудрякова, лаб. биохимии клеточной поверхности микроорганизмов ИБФМ РАН.

Ранее мы писали о работе лаборатории биохимии клеточной поверхности микроорганизмов ИБФМ РАН, посвященной механизму образования везикул у Lysobacter sp. XL1.