Производное токсина клостридии подавляет рост рака молочной железы в мышиной модели

В некоторых случаях химиотерапия рака молочной железы (РМЖ) может привести к размножению стволовых раковых клеток, устойчивых к терапии. Препараты, ингибирующие сигнальный путь Wnt, потенциально могут подавлять рост этих клеток, но применение таких ингибиторов ограничено их побочными эффектами. Побочные эффекты обусловлены тем, что у человека существует десять различных рецепторов семейства Frizzled (FZD), участвующих в Wnt-сигналинге. Авторы публикации в PLoS Biology показали, что воздействие только на три из этих рецепторов может уменьшить побочные эффекты. 

Группа ученых провела серию экспериментов с ингибитором Wnt TcdB^FBD, который был получен на основе токсина бактерии Clostridium difficile. Этот ингибитор направлен против сигналинга Wnt-FZD1/2/7. Препарат испытали на моделях мышей, имитирующих базальноподобный и люминальный рак молочной железы, и показали, что он замедляет рост опухолей, не повреждая другие зависимые от Wnt ткани.

Для выявления специфических рецепторов FZD, экспрессирующихся при базальноподобном раке молочной железы, авторы работы изучили экспрессию всех 10 типов рецепторов FZD в раке молочной железы человека и на мышиных моделях. Анализ показал, что экспрессия FZD 6, 7 и 9 находится на более высоком уровне в базальноподобном РМЖ по сравнению с другими подтипами. В мышиных моделях Fzd7 и Fzd6 были высоко экспрессированы в C3(1)-Tag и Trp53-отрицательных опухолях молочной железы, которые представляют собой мышиные модели базальноподобного и трижды негативного рака молочной железы человека.

Для дальнейшего изучения сигнального пути Wnt исследователи остановились на базальноподобной модели C3(1)-Tag с высоким уровнем экспрессии Fzd7 и модели люминального рака молочной железы MMTV-PyMT со средним и низким уровнем экспрессии Fzd7. Также они использовали модель мышиного базальноподобного рака молочной железы с потерей Trp53 и Brca1. Иммунофлуоресцентный анализ подтвердил, что в опухолях молочной железы C3(1)-Tag и в опухолях с дефицитом p53/BRCA1 содержится много опухолевых клеток, экспрессирующих базальный маркер — кератин 5, при этом рецептор эстрогена альфа во всех трех типах опухолей не экспрессировался.

Сначала авторы проанализировали активацию сигнального пути Wnt в этих опухолях на основании уровня активного β-катенина. Как в p53/BRCA1-дефицитных опухолях, так и в опухолях с C3(1)-Tag уровень активного β-катенина был выше, чем в опухолях MMTV-PyMT, что подтверждается иммунофлуоресцентным анализом и иммуноблот-анализом. Анализ методом количественной ПЦР показал, что в p53/BRCA1-дефицитных и C3(1)-Tag опухолях, но не в MMTV-PyMT опухолях, Fzd7 экспрессировался на более высоком уровне, чем все остальные гены Fzd.

Затем ученые проанализировали нормальные ткани молочной железы методом флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) с использованием анти-FZD7 антител. Среди живых клеток они выявили примерно от 1% до 5% FZD7-позитивных. Дальнейший анализ с использованием CD24 и CD29 в качестве маркеров показал, что FZD7+ клетки включают как люминальные, так и базальные эпителиальные клетки молочной железы. Опухолевые ткани MMTV-PyMT содержали сходные с нормальными тканями уровни FZD7+ клеток, тогда как в базальноподобных опухолях уровень этих клеток был повышен. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что количество FZD7+-клеток повышено в моделях базальноподобных опухолей молочной железы.

Чтобы оценить, может ли FZD7 служить терапевтической мишенью, авторы проверили способность TcdB^FBD ингибировать сигнальный путь Wnt в клеточной линии человеческого трижды негативного рака молочной железы MDA-MB-231 методом двойного люциферазного репортерного анализа. TcdB^FBD не влиял на жизнеспособность клеток линии MDA-MB-231 и других клеточных линий человека (U2OS, 293T и MCF7), что подтверждает нетоксичность препарата для клеток человека. 

Затем авторы подкожно вводили клетки MDA-MB-231 с интегрированным люциферазным репортером иммунодефицитным мышам. После этого им внутрибрюшинно вводили TcdB^FBD в дозе 20 мг/кг один раз в сутки в течение 6 раз. Для оценки сигнальной активности Wnt перед иссечением опухолей животным вводили D-люциферин, а затем измеряли сигнал свечения. Опухоли мышей, обработанных TcdB^FBD, показали примерно пятикратное снижение сигналов по сравнению с опухолями контрольных групп.

Авторы также протестировали воздействие TcdB^FBD на органоидах опухолей молочной железы. Для этого они обработали органоиды, экспрессирующие FZD7, этим препаратом. Обработка TcdB^FBD снижала жизнеспособность органоидов, сформированных из p53/BRCA1-дефицитных или C3(1)-Tag опухолевых клеток. Однакоона не влияла на органоиды, сформированные из клеток люминальной опухоли MMTV-PyMT.

Далее исследователи оценили способность TcdB^FBD подавлять рост клеток рака молочной железы человека. Они использовали две органоидные линии — 74T и 86T, которые представляют собой люминальную и базальноподобную линии рака молочной железы с низким и высоким уровнем сигнатуры BRCA1, соответственно. Люминальная органоидная линия 74T оказалась нечувствительной к обработке TcdB^FBD. Напротив, рост органоидов базальноподобной линии 86T снижался при воздействии TcdB^FBD. 

Затем авторы проверили, как влияет TcdB^FBD на чувствительные к Wnt ткани, такие как кишечник и кости. TcdB^FBD вводили мышам в дозах 20, 50 или 100 мг/кг дважды в неделю в течение 5 недель. Для изучения возможного воздействия на кишечник в конце пятой недели авторы вводили EdU, который встраивается в реплицирующиеся молекулы ДНК и маркирует активно пролиферирующие клетки. Обработка TcdB^FBD в дозах 20 и 50 мг/кг не привела к снижению уровня EdU в тканях кишечника. При дозе 100 мг/кг наблюдалось небольшое снижение, но оно не достигло статистической значимости. В микроструктуре бедренной кости мышей ученые не обнаружили отличий от контроля. Эти данные позволяют предположить, что TcdB^FBD может иметь низкую токсичность на клетки кишечника и костную ткань.

Далее авторы изучили эффективность терапии с помощью TcdB^FBD в комбинации с цисплатином.  Мышам вводили только TcdB^FBD, только цисплатин или комбинацию обоих препаратов. TcdB^FBD снижал рост опухоли, а его эффективность была аналогична лечению только цисплатином. Комбинированное лечение TcdB^FBD и цисплатином позволило достичь наиболее высокого уровня ингибирования роста опухолей, полученных из p53/BRCA1-дефицитных и C3(1)-Tag моделей. Эти результаты позволяют предположить, что использование FZD7 в качестве мишени может преодолеть устойчивость опухолевых клеток к цисплатину.

Данные, полученные в этой работе, служат доказательством терапевтической перспективности ингибиторов сигнального пути Wnt, нацеленных на его отдельные участники. 

Токсин из тропического растения замедляет рост опухоли при агрессивном офтальмологическом раке