Простой метод измерения длины теломер на основе ПЦР в реальном времени

Ученые из Сингапура разработали подход для измерения абсолютных длин теломер, основанный на ПЦР в реальном времени. Статья о новом методе, получившем название STAR (от англ. Single Telomere Absolute-length Rapid assay), опубликована в Science Advances.

Принципиальная схема метода STAR.

Credit: Yongqiang Luo, et al., 2020; DOI:  10.1126/sciadv.abb7944 | CC BY-NC 4.0

Отклонения длины теломер от нормальной наблюдаются при многих патологических состояниях: возрастных дегенеративных болезнях, сахарном диабете, сердечно-сосудистых заболеваниях. Кроме того, длина теломер служит важным прогностическим признаком для некоторых видов рака. Несмотря на клиническую значимость длины теломер, до недавнего времени не существовало способа ее определения, пригодного для рутинного использования в клинике.

В новой статье, опубликованной в Science Advances, сообщается о новом подходе для высокопроизводительного определения длины теломер, основанном на ПЦР в реальном времени. Стандартный протокол анализа теломер, известный как анализ терминальных рестрикционных фрагментов, громоздкий и требует не менее 1 мкг исходной ДНК. Для нового метода достаточно менее 1 нг ДНК. Кроме того, он относительно простой и потому подходит для применения в клинической практике. Новый метод получил название STAR от англ. Single Telomere Absolute-length Rapid assay.

Основной принцип STAR заключается в измерении количества теломерных повторов в теломере с помощью ПЦР в реальном времени, которая проводится на чипе для цифровой ПЦР в нанолитровых реакционных ячейках. В отличие от стандартной цифровой ПЦР, в случае STAR флуоресцентный сигнал в ходе амплификации отслеживается отдельно в каждой ячейке. Предварительно образец разбавляется так, чтобы в одну ячейку попала только одна теломера. Разным длинам теломер будут соответствовать разные величины Ct. Гетерогенность теломерной ДНК, содержащейся в образце, выявляется по различной кинетике амплификации в каждой ячейке. Весь протокол STAR занимает по времени около 3 часов и позволяет определить размеры теломер в широком диапазоне — от 0,2 до 320 тысяч пар оснований.

Авторы валидировали новый метод, измеряя с его помощью длины теломер в раковых клетках нескольких линий. Для сравнения длины теломер в клетках тех же линий также определяли стандартным анализом терминальных рестрикционных фрагментов. Результаты, полученные с помощью STAR, хорошо коррелировали с данными анализа терминальных рестрикционных фрагментов. Кроме того, авторы показали, что STAR подходит для количественного описания внехромосомных теломерных повторов, поддерживающих длину теломер у злокачественных клеток.

Исследователи полагают, что вместе с внедрением высокопроизводительной цифровой ПЦР в клинические лаборатории метод STAR найдет применение в медицине, и длина теломер будет рассматриваться как биомаркер разнообразных патологий.

Источник

Yongqiang Luo, et al. // Massively parallel single-molecule telomere length measurement with digital real-time PCR. // Science Advances, 2020, Vol. 6, no. 34, eabb7944; DOI: 10.1126/sciadv.abb7944

Добавить в избранное

Вам будет интересно