Раковые клетки посылают макрофагам микроРНК, чтобы стимулировать иммуносупрессию

Рак поджелудочной железы — одно из самых трудноизлечимых онкозаболеваний, пятилетняя выживаемость составляет около 13%, а число новых случаев постоянно растет. Одна из ключевых трудностей состоит в резистентности к терапии. Она связана с иммуносупрессивной средой в микроокружении опухоли, и уже известно, что ключевую роль в ее формировании играют опухоль-ассоциированные макрофаги. Однако о механизмах, лежащих в основе пластичности макрофагов и перепрограммирования их фенотипа, известно мало.

Исследователи из США предположили, что иммуносупрессивное микроокружение создается за счет опухолевых экзосом, которые воздействуют на макрофаги и перепрограммируют их в M2-подобный противовоспалительный фенотип.  

Чтобы проверить это, ученые выделили внеклеточные везикулы (EV) из среды, в которой выращивали клетки рака поджелудочной железы человека или мыши, а также неонкогенной линии эпителиальных клеток поджелудочной железы. Препараты везикул, полученные методом гель-фильтрации, состояли преимущественно из фракции экзосом. 

Опыты по интернализации флуоресцентно меченых везикул показали, что все типы EV поглощались макрофагами — как полученные от опухолевых клеток, так и неонкогенные. Однако авторы обнаружили, что у макрофагов, обработанных опухолевыми EV, менялся метаболический профиль. Внеклеточные уровни аргинина были снижены, а относительное количество лактата и цитруллина, наоборот, повышено. Дефицит важного для Т-клеток аргинина может подавлять их функции, а выработка лактата макрофагами индуцирует в них экспрессию PD-L1, что также способствует иммуносупрессии. 

Далее авторы оценили воздействие перепрограммированных макрофагов на пролиферацию Т-клеток. Оказалось, что макрофаги, поглотившие EV от раковых клеток, ингибировали пролиферацию CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов. Сами везикулы или необработанные макрофаги такого влияния не оказывали. 

Иммуносупрессивное действие макрофагов подтвердилось in vivo на иммунодефицитных мышах. Им вводили CD8⁺ T-клетки, активированные антигеном меланомы gp100 pMel-1. Через сутки им также вводили пептид gp100 и макрофаги, предварительно обработанные опухолевыми или контрольными везикулами, а через шесть дней анализировали иммунные клетки в крови и селезенке. Проточная цитометрия выявила, что в экспериментальной группе число жизнеспособных CD8⁺ T-лимфоцитов снижалось по сравнению с контролем, как в селезенке, так и в крови. 
Исследователи показали, что иммуносупрессия связана с индукцией PD-L1 макрофагах. Проточная цитометрия выявила на поверхности макрофагов, обработанных EV опухолевого происхождения, повышенный уровень PD-L1, результат вестерн-блоттинга и иммунофлуоресцентного анализа подтвердил эти данные. У иммунокомпетентных мышей C57BL/6, которым внутрибрюшинно вводили EV от раковых клеток, также усиливалась экспрессия PD-L1 на макрофагах брюшной полости. 

Кроме того, обработанные макрофаги усиленно секретировали IL-10 и TGF-β, которые, как известно, стимулируют экспрессию PD-L1. Ингибирование IL-10 и TGF-β антителами снижало иммуносупрессивное воздействие макрофагов на CD8⁺ Т-лимфоциты. Аналогичный эффект обеспечивали антитела к PD-1 или PD-L1. 

Проанализировав опубликованные данные пациентов с аденокарциномой поджелудочной железы, авторы установили, что экспрессия PD-L1 макрофагами обратно коррелирует с выживаемостью. 

Секвенирование РНК показало, что по профилю экспрессии макрофаги, обработанные опухолевыми EV, отличались от контрольных. Анализ генной онтологии выявил изменения в интерфероновом ответе (IFN-γ), TNF-α и сигнальных путях IL-6/JAK/STAT3. 

Появляющиеся данные указывают на то, что JAK2/STAT3 способствует перепрограммированию макрофагов в M2-подобный фенотип, а активация STAT3 в них ассоциирована с более высокой экспрессией PD-L1. Ученые проверили, связана ли M2-поляризация макрофагов под действием опухолевых везикул с активацией STAT3. Эксперименты по обработке макрофагов руксолитинибом — ингибитором JAK2/STAT3-сигналинга — подтвердили эту связь. 

Затем исследователи показали, что ключевым фактором, индуцирующим M2-поляризацию опухоль-ассоциированных макрофагов, служит микроРНК miR-182-5p, которая содержится в EV опухолевого происхождения. Ингибирование ее экспрессии в клетках рака поджелудочной железы приводило к потере проопухолевых свойств везикул, хотя они по-прежнему продуцировались раковыми клетками и поглощались макрофагами. 

Наконец, ученые оценили терапевтический потенциал ингибирования miR-182-5p in vivo. Они ортотопически подсаживали мышам C57BL/6 клетки протоковой аденокарциномы поджелудочной железы, а когда опухоль развивалась, начинали лечение ингибитором miR-182-5p. Мыши, получавшие ингибитор, отличались более длительной выживаемостью, а размеры опухоли у них были значимо меньше, чем в контрольной группе. 

Анализ опухолей на маркеры M1- и M2-макрофагов (CD86 и CD206 соответственно) показал, что после терапии ингибитором miR-182-5p значительно возрастало соотношение M1/M2. Это было ассоциировано с привлечением CD8⁺ T-клеток, их активацией и со сдерживанием роста опухоли. Полученный результат ученые подтвердили на более агрессивной модели, которая точнее отражает свойства рака поджелудочной железы у людей, и в опытах с комбинированным лечением, где мыши получали также химиотерапевтический препарат гемцитабин.

Таким образом, ингибирование miR-182-5p — микроРНК, с помощью которой раковые клетки перепрограммируют макрофаги на проопухолевый фенотип, — перспективный метод воздействия на микроокружение рака поджелудочной железы. Авторы надеются, что это воздействие повысит эффективность существующих методов терапии.

Восстановление активности cGAS в раковых клетках усиливает иммунный ответ на опухоль