Расширение генетического кода с помощью квадруплетных кодонов и направленной эволюции
Ученые из США получили набор тРНК с квадруплетными антикодонами на основе тРНК Escherichia coli методом направленной эволюции. Они создали полицистронный оперон, с помощью которого можно одновременно эффективно транслировать четыре разных квадруплетных кодона. Этот метод позволяет вносить множественные модификации в белки, синтезируемые in vivo.
Расширение генетического кода — инструмент, используемый для включения неканонических аминокислот в синтезируемые белки. Один из вариантов кодирования таких аминокислот — квадруплетные кодоны, то есть кодоны, состоящие не из трех, а из четырех нуклеотидов. Такие кодоны потенциально кодируют до 255 уникальных аминокислот. Большинство этих аминокислот не встречается в природе, но могут быть близкими модификациями канонических аминокислот. Такие модификации позволяют более «тонко настроить» белки под определенные исследовательские и прикладные задачи. Для того, чтобы клеточный аппарат трансляции смог эффективно синтезировать белки, закодированные с участием квадруплетных кодонов, ему нужна отдельная тонкая настройка. Требуется тщательный подбор всех компонентов, включая нуклеотидное окружение антикодонов в тРНК.
В новой работе ученые из США использовали ген β-галактозидазы Escherichia coli (lacZ). В этом белке выявили аминокислотные позиции, необходимые для его ферментативной активности (D202, H392, N461, E462, Y504 и H541). Затем провели селекцию «library-cross-library» для идентификации функциональных и предположительно специфичных тРНК, работающих только в системе квадруплетных кодонов/антикодонов (qtRNA). Вырожденные библиотеки квадруплетных кодонов для важных аминокислот в lacZ котрансформировали с вырожденной библиотекой антикодонов тРНК, выбирая таким образом пары кодон/антикодон для дальнейших исследований. Пары кодон/антикодон проверяли на репортерной конструкции с использованием гена люцеферазы (LuxAB), в который инкорпорировался квадруплетный кодон, или с использованием репортеров sfGFP и (или) mCherry.
Затем сконструировали набор qtRNA, взяв в качестве «каркаса» тРНК E. coli, кодирующие антикодоны всех 20 канонических аминокислот и инициаторный метиониновый антикодон; эти кодоны заменили на квадруплетные антикодоны 5′-UCUA-3′, декодирующие квадруплетный кодон UAGA.
Для получения эффективно работающих qtRNA использовали метод фагово-опосредованной непрерывной эволюции (phage-associated continuous evolution, PACE). При этом подходе qtRNA кодируется на селекционном фаге (SP) вместо минорного гена оболочки бактериофага M13 gIII. После инфицирования qtRNA может подавлять квадруплетный кодон в gIII, кодируемый дополнительной плазмидой AP, что приводит к комплементации gIII-дефицитного SP и размножению фага. Скорость клеточных мутаций в этой системе увеличивается за счет суперэкспрессии мутаторных белков, кодируемых плазмидой мутагенеза MP6.
Эту систему проверили на клетках с AP-плазмидами, несущими квадруплетные кодоны CGUU и UAGA в гене gIII, и с SP, кодирующими qtRNA с антикодоном к UAGA или дефицитными по ним. Только присутствие в системе кодонов и антикодонов к UAGA (но не отдельных элементов) приводило к устойчивому размножению фага. В опытах in vitro показали успешное аминоацилирование тРНК-синтетазами эволюционировавших qtRNA, а также ранее сконструированных qtRNA на основе разных каркасов. Мутации, фланкирующие последовательность антикодона, улучшали трансляционную эффективность qtRNA.
Используя синтетические и отобранные в ходе непрерывной эволюции qtRNA, авторы создали полицистронные опероны, кодирующие четыре взаимно ортогональных qtRNA с разными антикодонами, и с их помощью транслировали репортер sfGFP, содержащий соответствующие кодоны.
«Теоретически можно запрограммировать последовательность ДНК, которая будет транслироваться в живой клетке в белок, содержащий сложный набор модификаций, которые в противном случае было бы сложно или невозможно добавить», — говорит руководитель исследования Ахмед Бадран, доцент кафедры химии Исследовательского института Скриппса, США.
Источник
Erika A. DeBenedictis, et al., Multiplex suppression of four quadruplet codons via tRNA directed evolution // Nature Communications volume 12, Article number: 5706 (2021); DOI: 10.1038/s41467-021-25948-y