Разработали каскад флуоресцентных белков для наблюдения поколений клеток

На основе CRISPR-Cas9 создали систему, которая по прошествии времени переключает экспрессию флуоресцентных белков с одного цвета на другой в заранее заданной последовательности. Экспрессия белка определенного цвета сохраняется в клеточных потомках, что позволяет отследить временной ход клеточной дифференцировки и судьбы клеток-предшественников и их потомков в процессе развития организма. Технологию успешно использовали для отслеживания клеточных линий в мозге дрозофилы, а также проверили эффективность в эмбрионе данио рерио.

Credit:

Aukid | 123rf.com

Изучение «родословной» клеток, то есть того, где и когда клеточные линии получают специфические черты при развитии организма, имеет решающее значение для понимания молекулярных механизмов клеточной дифференцировки. Методы секвенирования единичных клеток позволяют системно охарактеризовать типы клеток, но не способны показать ход дифференцировки и судьбы отдельных клеток во времени. Для этого ранее использовались подходы, основанные на мечении клеток разными комбинациями флуоресцентных белков ( Brainbow) или на филогенетическом картировании мутаций, накапливающихся в процессе дифференцировки. Но и эти методы либо не позволяют отследить процесс во времени, либо не дают нужного разрешения.

В новой работе ученые обошли эти ограничения, создав трансгенные организмы: в клетки личинок дрозофилы вводили систему CLADES (cell lineage access driven by an edition sequence). CLADES — это генетически кодируемые переключатели на основе технологии CRISPR-Cas9, которые контролируют активацию и инактивацию репортерных генов флуоресцентных белков, чья экспрессия затем сохраняется в дифференцированных клетках-потомках. Таким образом можно отследить, какие линии дифференцируются раньше, а какие позже.

Переключатели являются генами гидовых РНК (gRNA) и в неактивном состоянии препятствуют трансляции флуоресцентных белков, так как находятся между старт-кодоном и остальной последовательностью белка, транскрибируются вместе с ним и сдвигают рамку считывания. Неактивные gRNA содержат внутри одной из шпилек сайт узнавания предыдущей gRNA, при вырезании которого рамка считывания флуоресцентного белка восстанавливается. Самая первая gRNA транскрибируется вместе с первым флуоресцентным белком, она изначально активна и запускает весь каскад. Инактивация «предыдущих» флуоресцентных белков происходит схожим образом. Инактивирующие gRNA также транскрибируются вместе с белком, но в этом случае gRNA с сайтом узнавания следующей не сдвигает рамку считывания белка, а при вырезании сайта рамка считывания нарушается, экспрессия белка прекращается. Ученые вставили между старт-кодонами и остальной кодирующей последовательностью нескольких флуоресцентных белков активирующие и инактивирующие gRNA так, что каждая вырезала сайт узнавания в последующей и активировала ее. В результате получали последовательную во времени и поколениях клеток смену цветов или их смешение (если активация следующего белка происходила перед инактивацией предыдущего).

Предложенный механизм позволяет чередовать до 5 цветов: зеленый (YFP), желтый (YFP+RFP), красный (RFP), фиолетовый (RFP+CFP) и синий (CFP). Систему применили на мозге дрозофилы, вставив белок Cas9 под тканеспецифичный промотор гена Dpn, который экспрессируется в нейробластах. Нейробласты в эмбрионе дрозофилы занимают вентральное положение, их потомки сдвигаются к спинной стороне по мере дифференцировки. Как и ожидалось, зеленое свечение ранних нейронов наблюдали ближе к вентральной стороне, а желтое и красное — ближе к спинной. При проверке системы на линиях латеральных нейронов ALad1, зеленым были мечены эмбриональные нейроны, а фиолетовым и синим — нейроны, дифференцировавшиеся в личинке. Система CLADES разделила развитие нейронов на временные окна, которые можно отследить в пределах одного индивидуума in vivo. К сожалению, изредка наблюдали сочетания зеленый-синий или зеленый-красный-синий одновременно, что связано с неточной репарацией двухцепочечных разрывов при вырезании сайтов узнавания gRNA или «протеканием» промоторов.

Чтобы было удобно манипулировать тканевой специфичностью системы, исследователи поставили флуоресцентные белки с gRNA под индуцибельный промотор UAS, который активируется белком-лигандом GAL4. При скрещивании линии мух CLADES с линиями, кодирующими GAL4 под тканеспецифичными промоторами, можно запускать CLADES в определенных тканях и клетках. При этом можно управлять включением Cas9 в определенный момент времени. Для этого его поставили под промотор, чувствительный к тепловому шоку.

CLADES можно «замедлить» и использовать для отслеживания поколений не клеток, а особей в популяции. Для этого авторы успешно использовали для экспрессии системы промотор гена bam, который временно активируется в герминальных клетках. В результате разные поколения дрозофил светятся разными цветами.

Авторы предполагают, что использование системы для исследования позвоночных животных также даст положительный результат. Система, содержащая переключатель для одного флуоресцентного белка, была инъецирована в эмбрион данио рерио, что привело к свечению 54% клеток эмбриона. Помимо отслеживания, система в теории позволяет манипуляции со стволовыми клетками: переключатели могут управлять экспрессией транскрипционных факторов и регулировать процессы дифференцировки клеток in vivo.


Источник

Garcia-Marques, G., et al. // A programmable sequence of reporters for lineage analysis // Nat Neurosci (2020). DOI: 10.1038/s41593-020-0676-9

Добавить в избранное

Вам будет интересно