Редакторы цитозина на основе CRISPR вносят много нецелевых мутаций

Никазы на основе белков системы CRISPR-Cas часто и успешно используют для направленного редактирования генома. Редакторы цитозина и аденина позволяют генерировать точечные необратимые мутации без образования двухцепочечных разрывов, и поэтому являются перспективными инструментами редактирования генома.

Редакторы оснований — это химерные ферменты, созданные из модификатора оснований — крысиного белка APOBEC1 у редактора цитозина и TadA Escherichia coli у редактора аденина — и каталитически неактивной нуклеазы Cas9. Редакторы цитозина превращают дезоксицитидин в дезоксиуридин, что впоследствии приводит к образованию дезокситимидина.

Ученые из Китая разработали новый метод Detect-seq для выявления сайтов, в которые вносит изменения редактор цитозина. Биотиновая метка присоединяется к промежуточному продукту редактирования, дезоксиуридину, после чего проводят преципитацию биотина. Это позволяет с высокой точностью выявлять сайты редактирования.

Когда ученые использовали Detect-seq на клетках HEK293T или MCF7, они обнаружили характерные паттерны мутаций в целевых сайтах, легко отличимые от фона, что исключает ошибки секвенирования. Затем исследователи разработали биоинформатический пайплайн для выявления сайтов редактирования по всему геному.

Неожиданно они обнаружили многочисленные нецелевые сайты редактирования. Частота нецелевого редактирования зависела от типа клеток, и ее нельзя было предсказать на основе последовательности гидРНК. Часть нецелевых мутаций находилась вблизи целевого сайта. Также исследователи отметили, что редакторы цитозина на основе Cas12a чаще редактировали геном вне целевого сайта, чем редакторы на основе Cas9, несмотря на более высокую точность нуклеазы Cas12a.

Главный автор статьи профессор Пекинского университета Чэнци И сообщил, что пока неизвестно, как часто вносят мутации в нецелевые сайты редакторы аденина. Однако идея оценки нецелевого редактирования с помощью захвата промежуточных продуктов редактирования может быть применена ко всем редакторам оснований.

Таким образом, разработанный подход позволит объективно анализировать эдитом — совокупность продуктов геномного редактирования — и оценивать специфичность новых инструментов редактирования генома.