РНК-интерференция снижает экспрессию мутантного гентингтина

Олигонуклеотиды — новый многообещающий класс препаратов, включающий малые интерферирующие РНК (миРНК). Эффективность миРНК во многом зависит от их стабилизации. Исследовательская группа из США недавно разработала оптимизированную архитектуру миРНК, которая позволяем им медленнее вымываться из спинномозговой жидкости и успешно проникать в нейроны, благодаря чему достигается долговременный сайленсинг генов в мозге мышей и обезьян. Одна инъекция такой модифицированной миРНК, таргетирующая мРНК гена HTT, приводит к сайленсингу последнего в течение шести месяцев.

Есть свидетельства того, что гентингтин дикого типа важен для нормальной работы нейронов, так что желательно селективно cнизить экспрессию именно мутантного белка. Тем более что фаза 3 клинических испытаний неселективных антисенс-олигонуклеотидов, таргетирующих HTT, недавно была прекращена из-за негативного эффекта терапии. Причина неясна, но влияние неселективного снижения экспрессии HTT нельзя исключать. В новой работе авторы создали химически модифицированные миРНК, таргетиующие только мутантный аллель, достаточно стабильные, чтобы работать в мозге мыши. Для этого исследователи использовали два SNP в гене HTT, rs362307 и rs362273, которые часто являются гетерозиготными у людей с болезнью Гентингтона. Эффективность терапии продемонстрировали на мышах.

Изначально исследователи провели скрининг химически стабилизированных миРНК. Для стабилизации использовались 2′-O-метил- и 2′-деокси-2′-фтор-группы, а также фосфоротиоаты и холестерин. Модифицированные таким образом миРНК успешно проникают во все типы клеток путем эндоцитоза. В результате скрининга in vitro авторы отобрали миРНК, которые были эффективнее всего при таргетированном сайленсинге репортерной плазмиды в клетках HeLa. После этого выбранные миРНК оптимизировали, в том числе внесли второй мисмэтч-сайт.

Эффективность отобранной миРНК продемонстрировали также на нейральных стволовых клетках человека, полученных из индуцированных плюрипотентных клеток со 109 CAG-повторами в гене HTT. В этих клетках SNP rs362273 находилась в гетерозиготе; мутантный гентингтин и белок дикого типа различали с помощью вестерн блота. Неселективная миРНК снижала экспрессию обоих белков, а селективная — только мутантного. Тот же эффект авторы продемонстрировали в нейронах коры.

Для работ in vivo авторы использовали мышиную модель, у которой в сайте rs362273 гена HTT находится G. В клетках этих мышей экспрессируется человеческий мутантный ген HTT, который в том же сайте содержит A. Область этого сайта консервативна у мышей и человека. Используя SNP, исследователи таргетировали человеческий мутантный гентингтин. Для этого они вводили миРНК в боковой желудочек мозга мышей. Через месяц после инъекции содержание человеческого и мышиного гентингтинов оценивали в разных отделах мозга. Мышиный гентингтин остался на прежнем уровне, а количество человеческого мутантного белка снизилось более, чем на 85%. Уровни других белков, характерных для мозговых клеток, также не отличались в контрольных и экспериментальных мышах. Микроглия не активировалась. Эффективность сайленсинга была дозозависимой.

Таким образом, исследователи продемонстрировали, что, используя химически модифицированные миРНК, можно добиться селективного сайленсинга мутантного гентингтина in vivo. Этот подход также можно применить для терапии других аутосомно-доминантных расстройств, когда нужно сохранить экспрессию нормального белка.

О терапии болезни Гентингтона — на PCR.NEWS