РНК-секвенирование для оценки динамики экспрессии в единичных клетках

Ученые из Нидерландов и США разработали новый метод оценки скорости синтеза и деградации мРНК. Метод основан на включении меченого аналога уридина во вновь синтезированные транскрипты и секвенировании РНК единичных клеток.

Количество копий мРНК в клетке отражает активность конкретного гена, которая может меняться в процессе клеточного цикла, дифференцировки или в ответ на изменения окружающей среды. Клетки млекопитающих используют различные стратегии регуляции уровня мРНК, однако выявить их на основе данных об уровне транскриптов в гетерогенных клеточных популяциях невозможно. Новый метод scEU-seq (single-cell EU-labeled RNA sequencing) позволяет оценить кинетические параметры синтеза и распада мРНК для единичных клеток, а значит, предсказать механизмы регуляции экспрессии генов в процессах деления и дифференцировки.

Для мечения вновь синтезированных мРНК клетки инкубировали с 5-этинил уридином (EU, аналог уридина, включающийся вместо него в РНК при транскрипции). Затем клетки разделяли и навешивали на EU, включенный в мРНК, биотиновые метки. После обратной транскрипции гибриды кДНК-РНК, содержащие биотин, отделяли от остальных на магнитных шариках, покрытых стрептавидином (стрептавидин связывается с биотином), формировали библиотеки и секвенировали.

Для оценки времени жизни и скорости деградации мРНК использовали короткую обработку EU с последующим выращиванием клеток на среде с обычным уридином. В результате EU оставался в более долгоживущих транскриптах, а в короткоживущие включался уридин. Варьируя время обработки EU и уридином, можно определить продолжительность жизни транскриптов, а используя кинетические математические модели — вычислить константы их синтеза и деградации.

Авторы применили метод для изучения динамики транскриптома в процессе смены фаз клеточного цикла у человеческих клеток К562, а также при дифференцировке клеток в кишечных органоидах. Параметры синтеза и деградации, определенные в ходе этой работы, позволили предсказать уровни экспрессии 528 генов. При этом их значения совпали с данными, полученными разработанным ранее методом CELseq2. Выяснилось, что существует три стратегии регуляции транскрипции. Авторы называют их кооперативной (cooperative), нейтральной (neutral) и дестабилизирующей (destabilizing).

Кооперативная стратегия характеризуется ростом константы синтеза при уменьшении константы деградации (и наоборот), что при делении клеток характерно для генов, отвечающих за формирование веретена деления, регуляцию митоза, компоненты сигналинга и фосфорилирования, репликацию и репарацию ДНК, а при дифференцировке — для генов секретируемых белков и компонентов комплекса Гольджи. При нейтральной стратегии константа синтеза практически не меняется по отношению к константе распада, что наблюдается при делении у генов белков микротрубочек, репарации путем гомологичной рекомбинации, цитокинов, инициации репликации и смены фаз деления. Дестабилизирующая стратегия заключается в одновременном росте или уменьшении констант синтеза и деградации мРНК, что при дифференцировке происходит для генов, отвечающих за оксидоредуктазную активность и метаболизм лекарств.

Таким образом, регуляция транскрипции затрагивает как синтез, так и деградацию мРНК. Полученные данные расширяют представление о динамике экспрессии генов индивидуальных клеток в гетерогенной популяции.