Российские исследователи создали биосенсор для изучения динамики воспалительных процессов

Группа российских ученых совместно с коллегами из Бельгии и Франции разработала генетически кодируемый биосенсор для визуализации (псевдо)гипогалогенных кислот и их производных в режиме реального времени на субклеточном разрешении. Биосенсор — это химерный белок, который состоит из сенсорного домена и флуоресцентного участка. Новый сенсор ученые назвали Hypocrates (сокращенно от Hypochlorite Ratiometric Sensor) в честь древнегреческого врача Гиппократа, который одним из первых описал процесс воспаления. При помощи нового инструмента авторы надеются подробней изучить механизмы воспаления, в которых принимают участие производные (псевдо)гипогалогенных кислот, на молекулярном уровне.

Активные формы кислорода (АФК) долгое время считались исключительно источником окислительного стресса в клетках. Однако со временем ученые признали роль, например, пероксида водорода, как сигнальной молекулы. Некоторые другие АФК, такие как (псевдо)гипогалогенные кислоты и их производные, участвуют в реакциях иммунного ответа, однако как именно эти молекулы выполняют свою сигнальную функцию, остается неисследованным.

Как правило, метаболизм (псевдо)гипогалогенных кислот изучают методом масс-спектрометрии по наличию вторичных продуктов гипогалогенного стресса. Такой метод не позволяет отслеживать динамику выработки и распространения (псевдо)гипогалогенных кислот в реальном времени. Эти вещества вырабатываются активированными нейтрофилами и некоторыми другими иммунными клетками при воспалении. В норме они помогают бороться с патогенами, но, если синтез выйдет из-под контроля, (псевдо)гипогалогенные кислоты могут повреждать собственные органы и ткани. Повышение концентрации веществ этой группы в тканях часто связывают с патологическими состояниями — атеросклерозом, заболеваниями сердечно-сосудистой системы и легких, болезнью Альцгеймера. Поэтому отслеживание их концентрации — важная задача.

Генетически кодируемые белковые биосенсоры позволяют в режиме реального времени отследить место образования этих соединений, их динамику и распространение в клетках. Для того, чтобы создать подобный сенсор, авторы интегрировали круговой пермутант желтого флуоресцентного белка в измененный репрессор транскрипции NemR, который в природе встречается у E. coli.

Индикатор селективно взаимодействует с активными формами (псевдо)галогенов, после чего его оптические свойства изменяются. Сигнал такого сенсора можно представить в виде изменения соотношения интенсивности флуоресценции при возбуждении светом с длиной волны в 500 и 425 нанометров.

Сигнал сенсора оказался достаточно стабилен при физиологических значениях кислотности среды, однако повышение pH до 8 вызывало сильное изменение ответа. Чтобы избежать неверной интерпретации сигнала, ученые создали контрольную версию сенсора, который отвечает только на изменение кислотности среды, но не на присутсвие производных (псевдо)гипогалогенных кислот.

Авторы визуализировали динамику гипогалогенного стресса в живых бактериях, поглощаемых первичной культурой нейтрофилов человека. Они также показали возможность использования сенсора для исследований in vivo. Для этого биосенсор протестировали на рыбках данио, которым ампутировали хвостовой плавник. Поскольку в реакция воспаления участвуют как и (псевдо)гипогалогенные кислоты, так и пероксид водорода, ученые одновременно использовали сенсор на H₂O₂, а также контрольный сенсор pH. Флуоресцентная микроскопия показала, что спустя 15 минут после ампутации части плавника оба сенсора ответили на увеличение концентрации (псевдо)гипогалогенных кислот и пероксида водорода. Вскоре после этого флуоресценция сенсора H₂O₂ сильно снизилась, тогда как сигнал сенсора (псевдо)гипогалогенных кислот угасал медленнее.

Таким образом, авторы создали генетически кодируемый сенсор на (псевдо)гипогалогенные кислоты и их производные, которые играют важную роль в работе иммунной системы. Этот инструмент может помочь в изучении механизмов воспалительных реакций на молекулярном уровне.

Один из авторов статьи — Дмитрий Сергеевич Билан, кандидат наук, старший научный сотрудник, руководитель группы метаболических основ патологии ИБХ РАН — ответил на вопросы корреспондента PCR.NEWS.

Как строилось взаимодействие с иностранными коллабораторами? Как была распределена работа между вами и иностранными группами?

Биосенсор Hypocrates — это инструмент, который, мы надеемся, будет успешно применяться в исследованиях. Для того, чтобы к новому инструменту было доверие, необходимо как можно детальнее охарактеризовать его свойства, продемонстрировать его потенциал. В нашей статьи мы показываем много данных, описывающих функционирование биосенсора. И, конечно, чтобы усилить работу, мы обращались к различным специалистам, с которыми уже ранее взаимодействовали по различным проектам. Например, доктор Йорис Мессенс (Dr. Joris Messens, Бельгия) является специалистом в области структурной биологии. Полученные результаты по исследованию механизма работы Hypocrates могут быть весьма полезны для понимания работы молекулярных инструментов подобного типа в целом.

Группа доктора Софи Фриз (Dr. Sophie Vriz, Франция) занимается исследованиями биологических процессов на модельном организме Danio rerio. Поэтому, когда появился новый инструмент, сразу же захотелось его протестировать in vivo. В команде доктора Фриз как раз имеется опыт работы с моделью воспаления — это лучшим образом подходит для тестирования биосенсора на гипогалогенные кислоты. Когда мы поняли, что Hypocrates работает в различных системах, результаты были опубликованы в совместной статье.

Как долго шла работа над сенсором от идеи и до статьи?

Технически биосенсор получился очень быстро, практически с первой попытки. Сложнее его было тестировать. Гипогалогенные кислоты — не самые простые соединения для исследований. Но я помню, что с некоторыми нашими предварительными результатами по Hypocrates мы впервые выступили на конференции в 2017 году. К лету 2020 года биосенсор уже был полностью готов и охарактеризован, в том числе был написан манускрипт. А дальше был проделан долгий путь по выбору журнала, затем переписка с рецензентами и редакторами — в итоге после пяти раундов рецензии статья была опубликована в Nature Communications в январе 2022 года.

Какие задачи стоят дальше в работе?

Гипогалогенные кислоты и различные их производные представляют своего рода «белое пятно». Известно, что это крайне агрессивные соединения. Некоторые клетки нашего организма продуцируют их для защиты, удаления чего-то ненужного, а при нарушениях в регуляционных механизмах эти же клетки формируют гипогалогенный стресс, повреждая собственные ткани. Новый инструмент позволяет визуализировать эти процессы в динамике.

Таким образом, Hypocrates можно использовать в модельных системах различных патологий, что позволит выявить новые молекулярные механизмы развития острого или хронического воспаления. Например, наша группа занимается исследованием патогенеза ишемического инсульта головного мозга. Недавно в сотрудничестве с лабораторией профессора Желтикова А.М. из МГУ, используя подобного типа генетически кодируемые биосенсоры, мы впервые исследовали в режиме реального времени динамику некоторых биохимических процессов в тканях мозга живых крыс при развитии инсульта. Многие заболевания мозга сопровождаются гипогалогенным стрессом. Поэтому Hypocrates представляет интерес для подобных исследований.

Есть еще одно интересное направление в этой области: в последние годы появляется все больше сведений в пользу того, что даже такие агрессивные соединения могут выступать в роли сигнальных молекул и специфично взаимодействовать с некоторыми биологическими мишенями. Поэтому предметом исследований с использованием Hypocrates могут быть не только патологические процессы в различных моделях заболеваний, но и физиологические, с целью выявить новые функции данного класса соединений.

Поскольку мы занимаемся разработкой биосенсоров, мы также продолжаем работы по созданию версий Hypocrates с новыми свойствами, что в дальнейшем расширит возможности применения биосенсора для решения самых разных задач в исследованиях.