Система CRISPR-Cas13d поможет бороться с коронавирусами

Американские ученые разработали CRISPR-систему для терапии нескольких штаммов SARS-CoV-2, включая омикрон. Система использует нуклеазу Cas13d, которая деградирует вирусную РНК под руководством CRISPR-ассоциированной РНК (crRNA).

Терапия на основе таргетирующих вирусы Cas13 обладает определенными преимуществами. Так, ее можно быстро переориентировать на новый вирус, для этого нужно только знание о последовательности его генома; если crRNA мультиплексные, то такая система обладает широким спектром действия; если таргетировать консервативные последовательности или несколько локусов, то мутации не приведут к потере эффективности терапии. Эффективность подобной системы ранее была показана на вирусе гриппа для клеток и животных моделей.

В новой работе авторы использовали Cas13d из Ruminococcus flavefaciens XPD3002. Из 23 crRNA, таргетирующих ген N, выбрали те, что позволяли с наибольшей эффективностью ингибировать репликацию коронавируса в клетках Vero E6. Ген N был выбран из-за его высокой консервативности. В результате отобрали SN1 и SN11, которые снижали вирусные титры на 96% и на 94% через 24 часа после заражения, а в комбинации — на 97%.

Изначально авторы работали с коронавирусом дикого типа WA1. Однако crRNA SN1 позволяет подавлять репликацию штаммов D614G, альфа, зета, эпсилон (B.1.427) и эпсилон (B.1.429). Изучение последовательности штаммов дельта и омикрон не выявило мутаций в таргетируемых последовательностях, которые могли бы препятствовать активности CRISPR-системы.

После этого исследователи получили crRNA, таргетирующие другой высококонсервативный вирусный ген RdRp, и показали, что созданная ими система может подавлять репликацию сезонного коронавируса HCoV-229E с эффективностью 97%, HCoV-OC43 — с эффективностью 99%, в комбинации — более 99%. Дальнейшие опыты проводили в основном на HCoV-229E, что возможно благодаря высокой консервативности цикла репликации коронавирусов.

Для работы системы важно, чтобы crRNA, Cas13d и вирусная РНК колокализовались в клетке. Также на человеческих клетках легочной карциномы A549 авторы показали, что система не влияет на экспрессию клеточных генов. Cas13d и антивирусные crRNA высокоспецифичны.

Также антивирусную эффективность CRISPR-системы можно повысить, если одновременно обработать клетки другими противовирусными препаратами, такими как EIDD-1931, ремдесивир, клофазимин, E-64d, элбасвир и велпатасвир. Так, EIDD-1931 и Cas13d/SN1 снижали вирусные титры в 5,9 и 2,9 раз соответственно, а совместно — в 32,2 раза. Авторы предположили, что совместное использование CRISPR-системы и противовирусных препаратов позволит снизить дозу последних.

Одновременно с вирусной РНК система позволяет подавлять экспрессию генов организма-хозяина, которые способствуют распространению вирусной инфекции, например, TMEM41B и TMEM106B. Использование Cas13d и crRNA, которые одновременно таргетируют вирусную РНК и мРНК TMEM41B или TMEM106B, значительно повышает уровень ингибирования HCoV-229E.

Cas13d мРНК и crRNA можно доставлять в клетку с помощью липидных наночастиц. Эффективность такого метода доставки проверили на клетках легких человека A549. Также авторы продемонстрировали хорошие результаты с лентивирусными векторами на человеческих первичных эпителиальных клетках бронхов (human primary bronchial epithelial cells, hPBEC) и MRC-5.

В конце эффективность новой терапии опробовали на культуре с интерфейсом воздух-жидкость, полученной из hPBEC. Липидные наночастицы доставляли crRNA в клетки такой культуры почти со 100%-ной эффективностью. Терапия снижала вирусные титры HCoV-229E на 78% через 48 часов после заражения и на 92% через 72 часа. Вирусные титры SARS-CoV-2 WA1 снизились на 54% через 24 часа после инфекции и на 97% через 48 часов. Титры омикрона также снижались на 70% через 24 часа после инфекции и на 85% через 48 часов, что подтверждает высокую консервативность таргетируемого crRNA участка.

Таким образом, CRISPR-Cas13d может действовать как антивирусный агент широкого спектра против нескольких вариантов SARS-CoV-2, включая омикрон, а также против других респираторных коронавирусов. При этом терапия не влияет на транскриптом клетки-хозяина. Также новая система может обеспечить защиту при коинфекции несколькими человеческими коронавирусами. Более того, Cas13d усиливает действие препаратов — малых молекул. Лучшая комбинация снизила вирусные титры более, чем в 5000 раз. Впрочем, авторы отмечают, что до клинического применения этого подхода еще далеко.