CRISPR использовали для разработки искусственных сигнальных путей

Бум геномного редактирования продолжается, и одним из основных генераторов новостей в данной области остаются системы с инактивированной нуклеазой Cas9. Мутантный фермент dCas9, не проявляя нуклеазной активности, специфически связывается с участком ДНК, которому комплементарна РНК-гид. В результате транскрипция в данном участке может быть заблокирована или, наоборот, активирована, если гидРНК направлена на промоторную область, а dCas9 работает в составе слитного белка с активатором транскрипции.

Указанный метод позволяет регулировать экспрессию генов, но только одноступенчато и достаточно грубо, практически на уровне включения-выключения. Бесспорно, CRISPRi, как называется данная технология, уже совершила революцию в области анализа функции генов, однако ее потенциал далеко не исчерпан.

Исследователи из Университета Делавара создали систему, в которой dCAS9 способна воспринимать сигнал извне и по этому сигналу активировать транскрипцию целевого гена. Для этого к 5’-концу гидРНК добавили особым образом организованный «хвост». Самая передняя, 5’-концевая часть этого РНК-хвоста комплементарна некой экзогенной РНК (о ней пойдет речь ниже), далее следует участок, образующий относительно низкоэнергетическую шпильку с фрагментом гидРНК, комплементарным ДНК-мишени, а затем остальная часть РНК-гида. Шпилька блокирует связывание гидРНК с ДНК. Эта структура получила название toehold-gated gRNA (thgRNA) — «гидРНК, регулируемая опорной РНК».

В комплексе с dCas9 модифицированная гидРНК может воспринимать внешние сигналы. Но не от белков, как в большинстве случаев сигнальной трансдукции в клетке, а от РНК. Для этого и служит ближняя 5’-концевая область модифицированной РНК-гида, которую исследователи назвали опорной РНК. «Опираясь» на нее, как на Архимедов рычаг, молекула-активатор, названная триггерной РНК, деблокирует активность Cas9 за счет разрушения шпильки. При этом триггерная РНК образует с РНК шпильки более прочный дуплекс, поэтому процесс обратного запирания комплекса Cas9 затруднен. Таким образом, продукция триггера в клетке (а им может стать любая РНК в зависимости от дизайна шпильки и опорной РНК) будет работать как сигнал для связывания dCas9 c ДНК-мишенью и модуляции транскрипции.

Исследователи проверили работоспособность метода in vitro вначале на активной Cas9: «запертая» нуклеаза не могла расщепить ДНК-мишень и активировалась только после добавления соответствующей РНК. В E. coli триггерная РНК «запирала» экспрессию репортерного белка люциферазы, при этом гидРНК, содержащая шпильку без опорной структуры, не блокировала продукцию репортера — опорная РНК показала себя необходимой. Специфичность запирания проверяли также в E. coli путем одновременной блокировки экспрессии в E. coli РНК, кодирующих флуоресцентные белки, а также двух природных РНК; специфичность была высокой, хотя в ряде случаев наблюдались отклонения, вызванные недостатками дизайна взаимодействующих участков РНК Полный контроль над экспрессией достигнут не был, тем не менее в ряде экспериментов в отсутствие триггера базовый уровень продукции заблокированной РНК оказался весьма низким.

Таким образом, создан принципиально новый метод искусственной регуляции транскрипции. Авторы указывают, что дальнейший анализ формирования РНК-дуплексов с применением компьютерного моделирования может привести к созданию более сложных каскадных систем регуляции на основе опорных и триггерных РНК.