Создана диагностическая система для выявления вируса В обезьян в полевых условиях

Смертность от зоонозного вируса В (ВВ) обезьян, который относится к герпесвирусам, достигает 80%. Китайские ученые разработали две тест-системы на основе консервативных участков генов US6 и UL27 и метода рекомбиназной полимеразной амплификации (РПА). Они показали, что система на основе участка гена US6 представляет собой простой, быстрый и специфичный метод обнаружения ВВ, который может быть использован в полевых условиях.

Вирус В обезьян относится к подсемейству Alphaherpesvirinae и вместе с вирусами простого герпеса 1 и 2 типов образует род Simplexvirus. Естественный хозяин ВВ — азиатская обезьяна рода Macaca, которая переносит инфицирование ВВ в легкой или бессимптомной форме. При этом ВВ вызывает у людей и других макак высокий уровень смертности. Отмечалась также вторичная  передача инфекции от человека к человеку. Особому риску заражения подвержены ветеринары и работающие с животными люди, поскольку передача ВВ происходит через укусы, царапины и другие травмы, нанесенные макаками.

Авторы исследования, недавно опубликованного в журнале Zoonoses, разработали две системы на основе метода РПА, нацеленные на два консервативных гена ВВ: RPA-VF-UL27 и RPA-VF-US6. Для каждой из систем с герметично закрытой вертикальной тестовой полоской визуализации (VF) они провели анализ чувствительности и специфичности, а также подобрали оптимальные параметры для проведения анализа. Они продемонстрировали, что RPA-VF-US6 может быть использована для выявления ВВ в полевых условиях без использования сложного оборудования.

Используемые в настоящее время системы диагностики ВВ основаны на методах ПЦР или ПЦР в реальном времени, что требует соответствующего оборудования и трудоемкой пробоподготовки. Преимущество анализа РПА заключается в том, что его можно проводить при комнатной температуре без использования сложных инструментов. Маркировка праймеров и зондов биотином и ФИТЦ (флуоресцеин-5-изотиоцианат) позволяет визуализировать продукты амплификации в виде красной полосы, видимой на тестовой полоске. Использование пластикового герметичного контейнера исключает перекрестное загрязнение продуктами амплификации.

Авторы использовали в разработке праймеры, специфичные к консервативным участкам генов UL27 и US6. И в том, и в другом случае оптимальная температура проведения реакции составила 42ºС. Для подбора времени реакции ее проводили в течение 20, 30 и 40 минут, и пришли к выводу, что оптимальное время составляет 30 минут. Чувствительность системы ученые протестировали с использованием 10-кратно разведенных стандартов плазмид, содержащих искомый фрагмент. При оптимальных условиях реакции система RPA-VF-UL27 была в восемь раз чувствительнее системы RPA-VF-US6. Так, система RPA-VF-US6 обладала пределом обнаружения в 28 копий, то есть специфически выявляла 28 копий плазмиды, содержащей участок гена US6 ВВ. Тест-система RPA-VF-UL27 позволяла выявлять 3,4 копии плазмиды, содержащей ген UL27, но, как показал дальнейший анализ, обладала более низкой специфичностью.

Для оценки специфичности системы ученые использовали образцы, содержащие вирус простого герпеса 1 типа, вирус псевдобешенства (вирус герпеса свиней 1), вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (бычий вирус герпеса 1). Только система на RPA-VF-UL27 дала перекрестную реактивность с вирусом простого герпеса 1 типа. В остальных случаях ложноположительных реакций не наблюдалось.

Использование систем при комнатной температуре (25ºС) подтвердило возможность их применения в таких условиях. RPA-VF-US6 выявляла 2800 копий плазмиды, содержащий ген US6. Авторы делают вывод, что разработанная ими тест-система на основе гена US6 может быть использована для применения в полевых лабораториях и при оказании помощи на месте.

Новые антитела спасли обезьян от смертельной лихорадки Ласса