Высокоселективные комплексы ДНК-аптамеров «позаимствовали» структуру у своих мишеней

Как быстро бороться с новыми и мутирующими вирусами, такими как COVID-19? Традиционные методы ищут моновалентные молекулы, чтобы затем использовать их для распознавания вирусного белка (как для детекции, так и для нейтрализации вируса). Однако многие вирусные белки состоят из нескольких субъединиц, например, у S-белка коронавируса их три — это затрудняет предсказание того, как против него сработает связующая молекула.

Руководствуясь этим, ученые из Швейцарии разработали стратегию MEDUSA (multivalent evolved DNA-based supramolecular assembly). «Мы провели реинжиниринг природной парадигмы, наблюдаемой у вирусов, в которой мультивалентные молекулярные комплексы коэволюционируют, и воплотили ее в новом методе обнаружения связующих веществ, который позволяет нам выбирать мультивалентные связующие вещества, способные блокировать такие вирусы», — объясняет идею работы первый автор статьи Артем Кононенко. Технология позволяет создавать комплексы из ДНК-аптамеров, точно подогнанные под геометрическую форму и симметрию вирусных белков.

В качестве целевого белка для разработки методики авторы выбрали тримерный S-белок SARS-CoV-2 — он служит надежным и наглядным примером вирусных белков слияния I класса. В соответствии с идеей воспроизвести его структуру, связывающий молекулярный комплекс также должен быть тримерным или «трехлопастным».

Эффективность связывания мультивалентных молекул сильно зависит от каркаса (скаффолда), соединяющего лиганды и определяющего их расположение и гибкость. Предыдущие исследования показали: чтобы связывание было максимально прочным, центральная часть каркаса должна быть жесткой и точно соответствовать по размеру мишени. А линкеры должны быть чуть длиннее, чем прямое расстояние от центра до точек связывания. С учетом этого исследователи in silico смоделировали SELEX (систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением — метод поиска таких связующих молекул). В этой модели использовали неподвижную мишень, структурно похожую на S-белок коронавируса, и анализировали, как форма каркаса влияет на силу связывания и оптимальную длину линкеров в разных условиях.

Форма скаффолда, на котором держатся связующие элементы, напрямую влияет на выбор длины линкеров. При точном соответствии форме мишени для идеального мультивалентного связывания подойдут самые короткие линкеры. Если же соответствие скаффолда и мишени неидеально, связывание в нескольких сайтах все равно возможно, но требует более длинных линкеров. Однако если различия по форме слишком сильны, молекулы начинают вести себя как моновалентные связующие агенты — в таком случае, как и для исходно моновалентных вариантов, длина линкера не играет роли.

Опираясь на результаты симуляции in silico , авторы предложили использовать циклический ДНК-каркас (cssDNA) с функционализированными полимерами нуклеиновых кислот (FNAP) — молекулами ДНК, нуклеозиды в которых модифицированы таким образом, чтобы обеспечить уникальные связывающие свойства. За счет циклического каркаса и модификаций нуклеозидов система устойчива к нуклеазам.

Разрабатывая FNAP, ученые получили библиотеки тринуклеотидов, из которых потом собирались полимеры с функционализированными нуклеотидами. Они провели несколько раундов селекции, синтезируя фрагменты FNAP по матрице ДНК и оценивая их аффинность к S-белку. Силу взаимодействия с мишенью измеряли также методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

После такого моновалентного тестирования ученые проанализировали комбинации FNAP, присоединенных к ДНК-каркасу. Они сравнили два варианта — в первом случае молекулы подвергались эволюции (то есть раундам селекции и синтеза) по отдельности, в другом случае эволюция была мультивалентной — ей подвергали собранный комплекс целиком. Второй подход показал себя более эффективным. Все семь полученных вариантов сборок, созданных вторым методом, продемонстрировали сопоставимую авидность к белку в наномолярном диапазоне; лидера по перспективности выделить было невозможно.

Примечательно, что трехвалентные сборки демонстрировали относительно медленные скорости как присоединения, так и отсоединения от целевого белка. Это может указывать на то, что для эффективного связывания и закрепления на мишени им требуются предварительные конформационные изменения.

Селективность сборок к мишени (S-белку того или иного штамма SARS-CoV-2) оказалась высокой. Протестированные варианты блокировали взаимодействие S-белка с его природной мишенью на человеческих клетках — рецептору ACE2, при помощи которого коронавирус проникает в клетку.

Используя принцип молекулярной коэволюции в мультивалентных структурах, метод MEDUSA позволяет разрабатывать настраиваемые лиганды на основе нуклеиновых кислот — их невозможно или слишком затруднительно получить, используя моновалентные связующие молекулы. Применимость метода подтвердилась на примере «нейтрализаторов» S-белка SARS-CoV-2 — разработанные структуры блокировали связывание этого белка с рецептором ACE2. В перспективе подход можно применять для борьбы с широким спектром вирусных угроз.

Метод smol-seq использует ДНК-аптамеры для количественной метаболомики