МД-2025: Технологические инновации молекулярной диагностики

Член-корр. РАН Елена Пономаренко (НИИ биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича) открыла секцию докладом «Мультиомные технологии в диагностике: проблемы и перспективы». Ключевое направление — ранняя диагностика с использованием постгеномных технологий, то есть тех, которые учитывают не только генетическую информацию, но и ее «реализацию» в живом организме.

Елена Пономаренко вместе с другими российскими учеными принимала участие в проекте Human Proteome, который стартовал в 2010 году. Вклад российских участников состоял в исследовании белков, гены которых находятся в хромосоме 18, включая разработку методов детекции. Эти методы должны найти применение в диагностике.

Елена Пономаренко

Дополнительная эффективность постгеномной медицины связана с тем, что она учитывает индивидуальные особенности человека, его развития, образа жизни, клинической истории. Если геном можно сравнить с эскизом автомобиля, а транскриптом — с чертежом, то протеом и метаболом — это показатели реально существующего автомобиля. Без эскиза не было бы готового объекта, и все же эскиз не дает полной информации.

Однако, хотя проект Human Proteome был завершен в 2014 году, до сих пор нет продуктов постгеномных технологий для предсказательной медицины и ранней диагностики. Проблема в том, что для обнаружения патологии на ранней стадии, когда терапевтическое вмешательство наиболее эффективно, необходимо выявлять сверхнизкие концентрации маркера. Например, при диаметре раковой опухоли 1 мм его концентрация может не превышать тысячи молекул на микролитр.

Один из возможных подходов для детекции малых количеств аналита — концентрирование биомолекул на поверхности чипа с лигандами и последующий анализ методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). Таким образом в НИИ биомедицинской химии детектировали коровый белок вируса гепатита С в сыворотке крови инфицированных людей. Методом атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии (АСМ/МС) можно детектировать вирусные белки, биомаркеры заболеваний. Тот же подход был применен при детекции белков хромосомы 18.

Другой вариант — нанопроводной детектор, в котором связывание аналита меняет проводимость нанопровода на чипе с иммобилизованными лигандами (антителами, аптамерами). Это совместная разработка ИБМХ, ИФП СО РАН и Новосибирского завода полупроводниковых приборов «Восток».

Для исследования функциональных свойств единичных белковых молекул может также использоваться нанопоровый детектор.

Уникальная научная установка (УНУ) «Авогадро» для определения низких и сверхнизких концентраций белков представляет собой объединение нескольких инновационных технологий — атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии, нанопроводного детектора и нанопорового секвенирования, которое дает информацию о генах и транскриптах.

Эффективность интеграции технологий была продемонстрирована при профилировании рака яичника. Количество идентифицированных в плазме белков, потенциально связанных с прогрессированием болезни, увеличилось в два раза по сравнению с методами традиционной протеомики. Авторы исследования выявили 21 потенциальный биомаркер, среди них затем отобрали 8 лучших. Анализ на эти биомаркеры показал высокую диагностическую точность (AUC 0,94).

Постгеномные технологии способны создать «мультиомный QR-код» болезни, включающий разные типы данных, для каждого человека. Наблюдая изменения этого показателя, можно заметить отклонение от персональной нормы, причем на самом раннем этапе — гораздо раньше, чем если сравнивать индивидуальные значения с популяционными референсными показателями, подчеркнула Елена Александровна.

Михаил Иванов (Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью ФМБА России) рассказал о базе данных популяционных частот генетических вариантов населения РФ. Она является одной из крупнейших в мире, включает результаты полногеномного секвенирования 120 тысяч человек и содержит информацию о более чем 550 млн уникальных генетических вариантов.

Михаил Иванов

Мировые базы данных, такие как ALFA и gnomAD, не отражают ситуацию с частотами в российской популяции. База RUSeq содержит российские образцы, но всего около 6000. Таким образом, Россия и Восточная Европа в целом практически не представлены в мировых источниках. Кроме того, большинство баз основано на результатах экзомного секвенирования, а выборки недостаточно репрезентативны (в них присутствует обогащение теми или иными фенотипами).

В ФМБА Росссии скрупулезно подходили к набору образцов, чтобы обеспечить репрезентативность, отметил докладчик. Были отсеквенированы геномы 200 тысяч человек с 30-кратным покрытием, из которых 120 тысяч стали основой для создания базы. В исследование включены жители 85 регионов РФ. Выборка собрана в результате популяционных исследований и не обогащена патологиями.

Самая востребованная опция — просмотр одного варианта. Среди преимуществ базы данных Михаил Вячеславович отметил быстродействие, дружественность интерфейса для пользователей различного уровня — от врача до биоинформатика, а также прозрачность в интерпретации результатов.

Темой доклада Дмитрия Ходакова (Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью ФМБА России) была разработанная им диагностическая платформа «Мультиплекс» на основе бубличной ПЦР.

Создание быстрых мультиплексных (то есть определяющих десятки мишеней) систем для анализа нуклеиновых кислот остается проблемой. Изотермическая амплификация подходит для этого не лучше или даже хуже, чем ПЦР. Секвенирование и микрочипы решают проблему мультиплексности, но требуют много времени, имеют высокую себестоимость и на данном этапе развития технологий не подходят для РОС (point-of-care, тестирование в местах оказания медицинской помощи), а микрочипы к тому же не дают информации о количестве мишени.

ПЦР имеет преимущества по цене и пригодности для количественного определения, но в классическом виде не подходит для детекции десятков или сотен мишеней в одном образце, а применение для РОС тормозится необходимостью термоциклирования. Эти проблемы может решить платформа «Мультиплекс», которая объединяет два инновационных решения — конвекционную ПЦР в тороидальной реакционной камере и одноразовый пластиковый ДНК-микрочип для детекции. Менее чем за полчаса она детектирует с высокой чувствительностью и специфичностью сто и более мишеней в минимальном объеме образца.

В типичном ПЦР-амплификаторе для проведения реакции температура раствора меняется за счет многократного нагревания и охлаждения массивного алюминиевого блока. Поэтому проведение необходимого числа циклов требует определенного времени, которое сложно сократить, и значительных затрат энергии.

В технологии «Мультиплекс» реакционная смесь находится в вертикально расположенной тороидальной камере, причем в одной половине она нагревается до 95 °С, в другой охлаждается до 60 °С, и благодаря этому возникает круговой поток жидкости. Раствор «самостоятельно» перемещается, периодически меняя температуру. Объем «бублика» — 25 мкл, и полный оборот жидкость совершает всего за 20 секунд. При определенных настройках ПЦР можно провести за 10 минут.

Дмитрий Ходаков

В камере также находится ДНК-микрочип, имеющий до 1024 ячеек с флуоресцентным зондами. С двухцепочечным зондом гибризидована молекула, несущая тушитель флуоресценции, и в отсутствие мишени флуоресцентный сигнал низкий. Но когда в реакционной смеси появляется ампликон, он вытесняет из комплекса тушитель, флуорофор начитает светиться, и возникает сигнал. Для детекции флуоресценции нужны также источник света и фотокамера, управляемые компьютером. Таким образом, десятки или сотни мишеней детектируются в режиме реального времени. По нарастанию интенсивности свечения в каждой точке на чипе можно построить кривую ПЦР.

Дмитрий Ходаков показал фото первых прототипов прибора (сконструированных из стекла, двустороннего скотча и микроскопа или камеры смартфона), а также предпромышленного прототипа.

С помощью «Мультиплекса» идентифицировали гены 16S рРНК 15 видов бактерий, а также SNP в человеческих геномах (15 генов и 30 SNP-специфичных зондов). Аллельную дискриминацию при исследовании родителей и ребенка удалось провести менее чем за 20 мин. Система продемонстрировала широкий динамический диапазон (возможность определять как большие, так и малые количества мишени) и хорошую воспроизводимость результатов. Ведутся работы по созданию диагностических панелей, например, для детекции урогенительных, респираторных, интраабдоминальных инфекций, инфекций почек. Предполагается создание решений как для лабораторного, так и для внелабораторного использования.

«Мультиплекс» может найти применения и в других областях, в которых традиционно используется ПЦР-тестирование, таких как криминалистика, фармацевтическая промышленность, сельское хозяйство. Что касается цены, Дмитрий Ходаков отметил, что целью является приближение к ПЦР-РВ.

Темой доклада Дмитрия Светличного (Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью ФМБА России) было исследование тяжелого течения COVID-19 с помощью одноклеточного секвенирования транскриптома.

Секвенирование транскриптомов единичных клеток позволяет выявлять известные и новые клеточные популяции в образцах, прослеживать траектории их развития, изучать межклеточные взаимодействия. Докладчик с коллегами использовали этот подход для исследования иммунных клеток крови у пациентов с COVID-19.

Дмитрий Светличный   

Было секвенировано 40 образцов мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) — суммарно более 420 тысяч клеток. Среди них выявили 21 подтип, в том числе подтип моноцитов MonIFI30, который обнаруживался только у пациентов с тяжелой формой COVID-19, вызванной штаммом дельта. Он характеризовался провоспалительным профилем экспрессии (CTSB, CST3, LGALS3), высокими уровнями экспрессии CXCLB, IFI30, C15orf48. У пациентов, инфицированных вариантом дельта, композиционные изменения затронули различные типы клеток. Моноциты в образцах этих пациентов отличались по экспрессии цитокинов, которые ассоциируются с тяжестью заболевания и повышенной смертностью. Изменился характер взаимодействий между клетками иммунной системы.

Помимо более активной экспрессии провоспалительных маркеров, в моноцитах наблюдалась повышенная экспрессия компонентов везикулярного транспорта (CD9, CD63) Это может указывать на вовлечение внеклеточных везикул в патогенез COVID-19 и более быстрое распространение штамма дельта.

Докладчик с коллегами также исследовали хроматиновый ландшафт PBMC у здоровых людей, недавно выздоровевших и переносящих тяжелый или средней тяжести COVID-19. Секвенирование открытого хроматина тоже указало на Mon IFI30 как на отдельный подтип, характеризующийся наличием открытых регуляторных элементов, связанных с провоспалительными генами.

В то время как PBMC пациентов с легкой и средней тяжестью заболевания были обогащены моноцитами CD16, у тяжелых пациентов снижалось количество классического подтипа моноцитов CD14, уменьшались фракции NK и CD4-клеток.

Кроме того, авторы проанализировали ассоциацию хроматиновых топиков (термин заимствован из нейролингвистики) и выявили взаимосвязи, которые способствуют развитию тяжелых респираторных патологий.

In silico моделирование пертурбаций генной экспрессии выявило транскрипционные факторы, ответственные за регуляцию Mon IFI30. Интересно, что in silico нокаут этих транскрипционных факторов сделал их похожими на нормальные моноциты CD16. 

Ольга Елисютина («ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России), практикующий врач, аллерголог-иммунолог, рассказала о неудовлетворенных потребностях аллергодиагностики.

Аллергические заболевания — эпидемия XXI века: 30–40% населения земного шара страдают тем или иным аллергическим заболеванием. Около 2% случаев сопровождаются анафилаксией. Клиническое подозрение на аллергическую сенсибилизацию подтверждается наличием аллергенспецифических антител IgE в кожных прик-тестах или in vitro с экстрактами аллергенов. Лабораторная диагностика  может проводиться с применением однокомпонентных и многокомпонентных (мультивалентных) методик, а также может включать более функциональные тесты, такие как тесты на активацию базофилов (BAT), что позволяет более точно определить профиль IgE у пациента.

Ольга Елисютина    

Согласно консенсусному документу по прецизионной молекулярной диагностике аллергии (PAMD@), лабораторная диагностика с использованием индивидуальных аллергенных молекул более информативна. В настоящее время все чаще встречается поливалентная сенсибилизация (чувствительность к множеству аллергенов). Перекрестная сенсибилизация (например, пищевая аллергия у человека с аллергией на пыльцу) может быть связана со структурным сходством разных аллергенных молекул. Кроме того, спектр аллергенов варьирует в зависимости от региона проживания пациента. Все это осложняет диагностику традиционными методами.

Появление мультиплексных систем диагностики, которые позволяют проверить чувствительность сразу к большому количеству аллергенов, привело к прорывам. «С другой стороны, мы не всегда знаем, как это интерпретировать, и может быть много избыточной информации», — подчеркнула Ольга Гурьевна.

Мультиплексная молекулярная диагностика показана конкретным пациентам с тяжелым течением аллергии при поливариантной сенсибилизации. Она позволяет провести дифференциальную диагностику, чтобы определиться с показаниями для аллергенспецифической иммунотерапии (АСИТ). До сих пор ее часто назначают эмпирически, хотя существует возможность определить сенсибилизацию на молекулярном уровне.

PAMD@, или компонентная молекулярная диагностика, основана на данных международной базы аллергенов, рекомендованной Всемирной организацией здравохранения и сообществом иммунологов. Эта база включает более 880 аллергенов. Например, пыльца березы содержит семь белковых компонентов, так что «аллергия на пыльцу» еще не является точным определением.

Для клиники выявление реакции на конкретное аллергенное соединение очень важно, потому что течение и тяжесть клинического ответа зависит от структуры белка. В частности, так называемые белки хранения (storage proteins) в составе пищевых продуктов, устойчивые к перевариванию и нагреву, могут вызывать тяжелые аллергические реакции. И для менее значимых аллергенов важна точная диагностика; сейчас, например, есть возможность различать аллергические реакции на самцов или самок животных, на слюну или мочу.

Такой подход позволяет давать точные прогнозы, рекомендации по диете или образу жизни и выбирать терапию отдельным пациентам. В то же время с помощью молекулярных подходов можно определять профиль сенсибилизации для жителей целых регионов.

Ольга Елисютина с коллегами изучали молекулярную сенсибилизацию у московских подростков; в исследовании участвовало около ста детей с аллергией, а также контрольная группа. Для анализа использовалась технология микроаллергочипирования ImmunoCAR ISAC (Immuno-Solid phase Allergen Chip).

Чаще всего иммунная система подростков распознавала основной аллерген пыльцы березы, Bet v 1  и основной аллерген кошки, Fel d 1; также достаточно часто встречались реакции на аллергены собаки и пыльцы трав. В исследовании пищевых аллергенов отмечалась перекрестная сенсибилизация с аллергенами пыльцы березы основных аллергенов яблока, орехов.

Среди тест-систем, которые имеются на рынке, — ImmunoCAR, ImmunoCAR ISAC, ALEX (Allergy E[plorer), ProAllergy, Protia Allergy-Q. Однако не все они адаптированы под региональные потребности, многие содержат избыточное количество аллергенов, и стоимость их производства слишком высока. Поэтому важно разработать аллергочип, отвечающий местным потребностям и с адекватной себестоимостью. «На сегодняшний момент мы начали проведение клинических испытаний системы молекулярной диагностики аллергии для наиболее актуальных для Российской Федерации видов аллергенов», — сказала Ольга Гурьевна. Ведется разработка аллергочипа, уже завершен этап получения исходных компонентов из природного сырья (в частности, чтобы собирать пыльцу, пришлось заключить договоры с фермерскими хозяйствами). Будут использоваться также рекомбинантные аллергены. Метод детекции основан на ИФА. Технология позволит выявлять в одной пробе специфичность к 50 аллергенам.

Отвечая на вопросы, Ольга Елисютина упомянула, что над долгожданной вакциной от аллергии работают в Сеченовском университете совместно о знаменитым австрийским ученым Рудольфом Валентой. А в Институте иммунологии проводится третья фаза клинических исследований рекомбинантной вакцины для лечения аллергии на пыльцу березы.

 О необычном исследовательском и диагностическом инструменте — гликановом эррее рассказала Надежда Шилова (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова).

 Надежда Шилова  

Помимо генома, транскриптома, протеома в человеческом организме существует гликом — совокупность гликанов, свободных и ковалентно связанных, которые участвуют в функционировании белков, дифференцировке клеток и многих других процессах.

В лаборатории углеводов ИБХ РАН и их коллег из ИОХ РАН за 25 лет работы была создана гликановая библиотека. Ее последняя версия содержит 800 гликановых лигандов. Их можно синтезировать, и они стабильны при хранении. В коллекцию входят терминальные и коровые фрагменты углеводных цепей гликопротеинов, опухоль-ассоциированные углеводные антигены, олигосахариды гликолипидов, антигены групп крови, а также углеводы, нетипичные для млекопитающих. Также в ней представлены полисахариды, выделенные из клеток бактерий и растений.

Гликановую библиотеку можно напечатать на предметном стекле и создать инструмент для анализа углеводсвязывающих белков — гликочип. Этот подход был предложен еще в 2004 году. Для детекции может использоваться антитело к белку с флуоресцентной меткой. Таким образом, в одном эксперименте можно получить профиль специфичности к сотням лигандов.

Гликочип — незаменимый инструмент в исследовании интерактома. С гликанами взаимодействуют углевод-превращающие ферменты, лектины, антитела. К лектинам относится вискумин — потенциальный противоопухолевый препарат, и гликочипы могут помочь в поиске его мишеней. Также с помощью гликочипа можно отслеживать изменчивость рецепторной специфичности вирусов или адгезинов бактерий и фагов.

Большой интерес представляют антигликановые антитела. Их репертуары у здоровых людей сходны, но при онкологических или аутоиммунных заболеваниях их уровень может снижаться. Следовательно, они имеют потенциал как биомаркеры. Антигликановые антитела в онкодиагностике, как показывают пилотные испытания, превосходят используемые онкомаркеры. Они могут найти применение и в прогностике, например, для выявления респондеров и нереспондеров на терапию или прогноза развития немелкоклеточного рака легкого у курильщиков.

Для практической диагностики вместо гликочипа можно применять суспензионный эррей, содержащий частицы с уникальными цветовыми кодами. Детекция проводится методом проточного лазерного анализа частиц.

Сравнение антител, входящих в сигнатуру рака молочной железы, с сигнатурой здоровых донором, может указать на антигликановые антитела с терапевтическим потенциалом, отметила докладчица. Есть работа на мышах, в которой изучалась гликолипидоподобная малая молекула, модифицирующая клетки опухоли. После этого антитела распознают опухоль и убивают, что приводит к иммунизации животного и уничтожению опухолей в других локациях. Таким образом, антигликановые антитела выступают как триггер развития иммунного ответа.

Завершил пленарное заседание доклад Натальи Куклиной (Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью ФМБА России) о выявлении мутаций, ассоциированных с онкозаболеваниями, с помощью масс-спектрометрии.

Наталья Куклина

Каждый год ВОЗ фиксирует десятки миллионов новых случаев онкозаболеваний в мире. В РФ по данным за 2024 год их было почти 700 тысяч. Важное направление молекулярной онкодиагностики — детекция соматических и герминальных мутаций, связанных с ответом на таргетную терапию.

Помимо традиционных методов анализа нуклеиновых кислот (ПЦР-РВ, секвенирование, FISH), для этого применяется масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией и ионизацией (MALDI-TOF MS). Ее преимущества — способность выявлять однонуклеотидные варианты, быстрота и точность, высокий уровень мультиплексирования. Минусы в том, что, в отличие от секвенирования, MALDI-TOF выявляет только предопределенные мутации.

Докладчица рассказала о генетическом спектрометре MALDI-TOF MASSARRAY (Agena Bioscience), о том, как происходят подготовка и анализ образца, о визуализации и обработки данных. Она объяснила, как выполняется генотипирование методом MALDI-TOF (к праймеру присоединяется ddNTP с необычной структурой, не содержащий остатка сахара; разница масс таких ddNTP достаточно велика, чтобы обеспечить высокую точность генотипирования).

Существует возможность разработки собственных панелей или добавления мутаций в уже существующие панели. Таким образом были сконструированы четыре панели — для выявления статуса мутация при колоректальном раке, раке молочной железы и яичника, раке легкого и меланоме. В заключение Наталья Куклина рассказала о возможностях импортозамещения в данной области.

Метод масс-спектрометрии — золотая середина между ПЦР и NGS, подчеркнула докладчица; он экономически выгоден, идеален для рутины и скрининга. Следует, однако, рассматривать его как дополнение NGS, а не его замену.

Информация о докладчиках

Пономаренко Елена Александровна, член-корр. РАН, д.б.н. ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича», Москва

Иванов Михаил Вячеславович, ФГБУ «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» ФМБА России, Москва

Ходаков Дмитрий Андреевич, к.б.н., ФГБУ «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» ФМБА России, Москва

Светличный Дмитрий Владимирович, PhD, к.б.н., ФГБУ «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» ФМБА России, Москва

Елисютина Ольга Гурьевна, д.м.н., доцент, ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва

Шилова Надежда Владимировна, к.б.н., ГНЦ Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Москва

Куклина Наталья Григорьевна, к.б.н.. ФГБУ «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» ФМБА России, Москва