Тест на основе нанопорового секвенирования выявляет респираторные инфекции, включая SARS-CoV-2

Команда Мо Ли из Научно-технологического университета короля Абдуллы (Саудовская Аравия) в сотрудничестве с исследователями из других научных центров Саудовской Аравии, США и Испании разработала тест для детекции различных вариантов SARS-CoV-2, а также других респираторных вирусов, методом нанопорового секвенирования.

Симптомы коронавирусной инфекции неспецифичны, по ним невозможно достоверно определить, инфицирован ли человек именно новым коронавирусом. Даже если ПЦР-тест на коронавирус положительный, возможна коинфекция другим респираторным вирусом. Поэтому нужны методы мультиплексной диагностики респираторных вирусов. Тесты для мультиплексной диагностики существуют, однако и ОТ-ПЦР в реальном времени, и NGS должны проводиться в лаборатории. Для быстрого тестирования их пытаются заменить изотермической амплификацией и нанопоровым секвенированием. Обе эти технологии использует тест LAMPore COVID-19, разработанный в Oxford Nanopore и уже получивший маркировку СЕ. LamPORE COVID-19 идентифицирует три участка в геноме коронавируса (гены белков E, N и ORF1a).

Авторы новой работы создали тест-систему под названием NIRVANA, которая выявляет пять участков генома коронавируса, причем более протяженных, чем LamPORE: это важно для распознавания штаммов. Еще две мишени находятся в геномах других возбудителей респираторных заболеваний. Таким образом, идея в том, чтобы сделать мультиплексный тест, определяющий сразу несколько возбудителей в одном образце.

Из образцов выделяют РНК, создают библиотеки кДНК, затем проводят изотермическую амплификацию с несколькими парами праймеров. Были созданы пять пар праймеров для пяти участков генома коронавируса, содержащих характерные для новых штаммов мутации либо горячие точки мутагенеза. Еще три пары праймеров добавили для амплификации участков генома вируса гриппа А, человеческих аденовируса и коронавируса. Секвенировали на приборе MinION (Oxford Nanopore). Для обработки данных использовали биоинформатический протокол Real-Time Nanopore sequencing monitor (RTNano).

Работая с клиническими сотрудниками из больниц в Мекке, Медине и Джидде, команда проверила метод NIRVANAна мазках из носа и горла от пациентов, предположительно инфицированных SARS-CoV-2. Из 66 образцов 35 были идентифицированы как положительные по SARS-CoV-2 через два часа нанопорового секвенирования, и еще 10 — в следующие 22 часа. Из этих 45 для 43 также проводили анализ с помощью ОТ-ПЦР, и для 41 он оказался положительным (в двух остальных реакция не прошла). Среди образцов, отрицательных по данным NIRVANA, для трех результат ПЦР-анализа также был отрицательным, а остальные 11 оказались положительными. При этом положительный результат был получен после большого числа циклов, что говорит о низких концентрациях вирусной РНК. Тем не менее это означает, что чувствительность NIRVANA недостаточно высока. (У теста LamPORE COVID-19 чувствительность превышает 99%.)

Четыре образца были положительными по вирусу гриппа А, один из них идентифицировала также NIRVANA. Один образец содержал РНК человеческого коронавируса, отличного от SARS-CoV-2, но NIRVANA его не идентифицировала.

Уменьшение количества пар праймеров к геному SARS-CoV-2 улучшило чувствительность. По мнению авторов, ее еще повысит дальнейшая оптимизация праймеров. Среди достоинств метода они отмечают высокую пропускную способность (возможность анализировать 96 образцов одновременно) и возможность идентифицировать как известные, так и новые мутации в наиболее «опасных» участках генома.

Авторы также исследовали с помощью своего теста образцы сточных вод, собранные в университете, чтобы проверить, можно ли использовать этот метод для эпиднадзора за SARS-CoV-2 и другими вирусами. В этом варианте метода амплифицировали пять участков генома SARS-CoV-и один участок генома вируса слабой крапчатости перца PMMoV, который можно использовать в качестве индикатора фекального загрязнения.