Токсоплазма доставляет терапевтические макромолекулы в мозг мыши

Серьезное препятствие для доставки многих терапевтических препаратов в головной мозг — гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), непроницаемый для крупных молекул, в том числе для большинства белков. В исследовании, опубликованном в Nature Microbiology, был предложен новый способ преодоления ГЭБ для макромолекул массой от 100 кДа. Для этого использовался паразит Toxoplasma gondii, который доставляет эффекторные белки в клетки-мишени, а затем высвобождает их с помощью системы секреции — роптрий и плотных гранул. T. gondii беспрепятственно проходит через ГЭБ и живет преимущественно в нейронах.

Поскольку сигналы локализации белков в роптриях и плотных гранулах неизвестны, ученые создали гибридные белки, которые могли бы селективно связывать компоненты этих систем секреции. Так был выбран белок токсофилин, способность которого взаимодействовать с роптриями была показана ранее, а также GRA16 для взаимодействия с плотными гранулами. Далее были выбраны наиболее перспективные терапевтические препараты для головного мозга белковой природы, которые были сшиты с токсофилином или GRA16.

Авторы подтвердили локализацию гибридных белков, состоящих из токсофилина и GDNF, Parkin, TFEB, ZFN или Cas9, в роптриях. В инфекционном цикле T. gondii содержимое роптрий попадает напрямую в цитозоль клетки-мишени, а содержимое плотных гранул сначала оказывается в вакуоли, которая отделяет паразита от цитозоля. Чтобы белки плотных гранул покинули вакуоль, им нужно пройти через очень селективную систему белкового транспорта на поверхности вакуоли. Авторы работы создали серию сшитых белков, в основе которых лежал не токсофилин, а GRA16. В итоге сшитые с GRA16 ядерные белки SMN1, TFEB и MeCP2 локализовались как в вакуоли, так и ядре клетки-хозяина. Наиболее четко локализация проявлялась в случае TFEB и MeCP2, поэтому в дальнейшем ученые сконцентрировались на этих белках.

T. gondii может доставлять в нейрон несколько белков одновременно, используя и роптрии, и плотные гранулы. Авторы экспрессировали в клетках токсофилин, сшитый с рекомбиназой Cre, а также белок GRA16-MeCP2. Через 48 часов наблюдались как белок GRA16-MeCP2, так и признаки активности рекомбиназы.

Далее исследователи наблюдали за кинетикой инфекции и доставки белков с помощью собственной системы визуализации. Было показано, что через 24 часа после заражения около 50–62% фибробластов кожи человека были инфицированы, а из них 73–86% экспрессировали нужный белок.

Далее авторы подтвердили заражение и доставку белков на нейронах. Они показали, что MeCP2 связывает хроматин нейронов и метилированную ДНК, то есть MeCP2 взаимодействует преимущественно с гетерохроматином. GRA16-MeCP2 выявляется в скоплениях гетерохроматина в ядрах инфицированных нейронов. Исследования на органоидах показали, что доставка MeCP2 изменяет экспрессию генов. В качестве вектора для доставки белков в нейроны мышей ученые предложили использовать штамм Type II Pru с низкой вирулентностью, который вызывает бессимптомную инфекцию у мышей. Авторы особенно подчеркивают, что перенос MeCP2 никак не сказывается на биологии токсоплазмы. Детальное исследование мозга мышей показало, что токсофилин-Cre доставляется в клетки с большей эффективностью, чем GRA16-Cre. Чаще всего успешную доставку MeCP2 регистрировали в коре, гиппокампе, стволе мозга, гипоталамусе и таламусе.

Авторы исследования надеются, что разработанный ими метод найдет применение в задачах по доставке самых разных белковых грузов.

Уникальные органеллы паразитов как мишень для терапии