Тройной нокдаун в CAR T-клетках снижает их токсичность, сохраняя эффективность

Одна из проблем при разработке CAR T-терапии солидных опухолей — отсутствие опухоль-специфичных антигенов. Антигены, представленные на опухолях, в меньших количествах экспрессируются и на здоровых клетках, что приводит к токсичности терапии. Китайские ученые предложили стратегию, позволяющую снизить токсичность за счет тройного нокдауна CD11a, CD49d, PSGL1 — молекул, опосредующих адгезию и миграцию Т-клеток из сосудов в ткани.

Миграция Т-клеток из кровеносных сосудов в ткани состоит из нескольких этапов. Сначала происходит хемотаксис Т-лимфоцитов, которые воспринимают хемокины — сигналы о миграции, что приводит к активации поверхностных интегринов, таких как LFA-1 (состоит из CD11a и CD18) и VLA-4 (состоит из CD49d и CD29). Затем происходит адгезия Т-клеток и эндотелиальных клеток, что опосредуется PSGL1 — эта молекула связывается с P-селектином на поверхности эндотелия. Активированные LFA-1 и VLA-4 также способны связываться с молекулами на поверхности клеток сосудов, такими как ICAM-1 и VCAM-1. Наконец, в ходе трансэндотелиальной миграции Т-клетки преодолевают сосудистый барьер посредством диапедеза, просачиваясь между эндотелиальными клетками. Именно на этом процессе и сосредоточились ученые.

В качестве примера для проверки эффекта нокаута/нокдауна молекул, опосредующих миграцию и адгезию Т-клеток, ученые использовали анти-EpCAM CAR T-клетки. EpCAM экспрессируется на высоком уровне в различных опухолях, в том числе в колоректальной карциноме, аденокарциноме поджелудочной железы и т.д. Однако эта молекула также представлена на здоровых тканях: например, в кишечнике и эпителии легких. В результате CAR T-клетки проявляют цитотоксическую активность не только против опухолевых клеточных линий, но и против здоровых клеток. Введение анти-EpCAM CAR T-клеток мышам in vivo способствовало специфической токсичности: и здоровые животные, и животные с опухолью на фоне терапии теряли вес, проявляли признаки системного повреждения тканей и печени. Сама терапия была токсична вплоть до летального исхода.

Для начала ученые заблокировали VLA-4 и LFA-1 с помощью антител. Блокировка только одного из интегринов или их обоих не влияла на экспансию Т-клеток и на их цитотоксические свойства против EpCAM+ опухолевых клеточных линий. Комбинированная блокировка VLA-4 и LFA-1 снизила способность CAR T-клеток к миграции и адгезии к эндотелиальным клеткам. Если in vivo применялось антитело только к одному из этих интегринов, на фоне терапии анти-EpCAM CAR T-клетками в летальной дозе повышалась выживаемость животных, но наблюдалась потеря веса. Однако комбинация антител против обоих интегринов и улучшала выживаемость, и предотвращала потерю веса животных. Вместе с тем снижались признаки повреждения печени и системного повреждения тканей.

На следующем этапе ученые решили проверить, как отразится нокдаун или нокаут одной из субъединиц LFA-1 или VLA-4 на функции CAR T-клеток. Во всех случаях подавление экспрессии одной из субъединиц или ее делеция никак не сказывались на пролиферации или цитотоксической активности CAR T-клеток. Зато такой нокдаун или нокаут снижал тонический сигналинг (tonic signaling), который может привести к активации CAR T-клеток в отсутствие антигена. Это снижало истощение Т-клеток и способствовало их дифференциации в Т-клетки памяти, что улучшает эффективность CAR T-терапии.

Однако нокдауна только одной из молекул, входящих в состав VLA-4 и LFA-1 — CD11a, CD18, CD49d или CD29 — было недостаточно, чтобы решить проблему токсичности. Даже при сублетальных дозах CAR T-клеток с таким нокдауном мыши погибали в течение недели после инфузии.

Тогда ученые решили провести двойной нокаут субъединиц, входящих в состав VLA-4 и LFA-1. Скрининг показал, что наилучшего результата можно добиться при нокауте пары CD11a и CD49d. При введении CAR T-клеток с двойным нокаутом мышам повышалась выживаемость животных, они меньше теряли в весе, снижалась концентрация маркеров повреждения печени и других тканей.

Тем не менее, использование именно двойного нокаута (а не нокдауна) вызвало у ученых опасения, так как эффективность двойного нокаута довольно низкая, а в результате снижается выживаемость клеток. В итоге ученые остановились сначала на двойном нокдауне CD11a и CD49b, но при этом все равно наблюдали потерю веса животных. Это показало, что даже незначительных остаточных количеств этих молекул достаточно для миграции Т-клеток. Тогда исследователи провели тройной нокдаун не только CD11a и CD49b, но и PSGL1, чтобы помешать и миграции, и адгезии Т-клеток. Даже при летальной дозировке CAR T-клеток с тройным нокаутом не наблюдалось внеопухолевой токсичности in vivo.

Последующие эксперименты были направлены на то, чтобы доказать, что тройной нокдаун CD11a, CD49b и PSGL1 не влияет на разные аспекты эффективности CAR T-клеток. Так, не изменялась их способность к проникновению в солидные опухоли, хотя при этом CAR T-клетки меньше проникали в здоровые ткани легких и печени. Также тройной нокдаун уменьшал истощение CAR T-клеток за счет сниженного тонического сигналинга, улучшая при этом их дифференцировку в Т-клетки памяти. Цитотоксическая активность CAR T-клеток с тройным нокдауном сохранилась против EpCAM+ опухолевых клеточных линий, причем истощения Т-клеток не происходило даже после четырех раундов стимуляции EpCAM+ опухолевыми клетками. Противоопухолевую активность CAR T-клетки с тройным нокдауном показали также in vivo.

Таким образом, стратегия исследователей, направленная на блокировку миграции и адгезии CAR T-клеток из сосудов в ткани, снизила специфическую внеопухолевую токсичность терапии, при этом сохранив ее эффективность против солидных опухолей у мышей.

Эффективность CAR T-терапии множественной миеломы подтвердили в реальных условиях