У двух детей с ложноположительными результатами скрининга на СМА обнаружили новую изоформу белка SMN

Спинальная мышечная атрофия (СМА) — аутосомно-рецессивное нервно-мышечное заболевание, которое сопровождается прогрессирующей дегенерацией моторных нейронов и атрофией мышц. Приблизительно у половины людей с биаллельными вариантами гена SMN1, приводящими к потере функции, без лечения развивается СМА I типа (неспособность сидеть или ходить или смерть в раннем возрасте). Скрининг новорожденных на СМА) обеспечивают быструю диагностику и позволяет начать терапию таргетными препаратами (Спинраза, Эврисди, Золгенсма) до появления симптомов, с максимальным эффектом. Стандартные ПЦР-тесты определяют биаллельные делеции экзона 7 гена SMN1 и таким образом выявляют около 95% случаев СМА; однако редкие варианты могут остаться незамеченными. 

Авторы статьи в American Journal of Human Genetics — ученые из Кельнского университета, Университета Гриффита и других научных центров в Германии и Австралии — охарактеризовали два варианта гена SMN1, обнаруженных в ходе скрининга новорожденных. Оба варианта кодируют измененный вариант белка SMN, который вырабатывается в пониженной концентрации и тем не менее не приводит к развитию спинальной мышечной атрофии (СМА).

Варианты были обнаружены у двух младенцев; девочка родилась в Германии, мальчик в Австралии. Первоначальный скрининг показал наличие вариантов с потерей функции в обеих копиях гена SMN1 — результат, который интерпретируется как наличие генетической причины СМА. Подтверждающее тестирование методом мультиплексной лигазозависимой амплификации зондов (MLPA) или мультиплексной капельной цифровой ПЦР показало, что у каждого из этих детей одна, возможно, функциональная копия гена SMN1 все же присутствует.

«У большинства пациентов с СМА обнаруживается гомозиготная делеция гена SMN1, которая надежно выявляется с помощью скрининга новорожденных, — пояснила в электронном письме первый автор исследования Брунхильда Вирт, руководитель Института генетики человека Кёльнского университета, отвечая на запрос портала GenomeWeb. — Только в том случае, если подтверждающий тест не воспроизводит результат неонатального скрининга, следует проводить дальнейшее расследование расхождения. В таких случаях рекомендуется ген-специфическое секвенирование гена SMN1… для выявления потенциальных вариантов, которые могли повлиять на первоначальный результат неонатального скрининга».

Таргетное секвенирование по Сэнгеру обнаружило у этих детей варианты гена SMN1 с неопределенным клиническим значением (VUS) — у одного SMN1 c.855_858delAGAA, у другого SMN1 c.861_864delAAGG. Оба варианта представляли собой четырехнуклеотидные делеции в экзоне 7 SMN1, оба приводили к сдвигу рамки считывания и появления преждевременного стоп-кодона (p.Arg288AlafsTer5). Они также затрагивали сайт связывания праймера, который используется при ПЦР-тестировании в ходе неонатального скрининга, чем и объяснялись ложноположительные результаты.

В клинике СМА также важную роль играет продукт другого гена, SMN2 — он смягчает проявления болезни при повреждении SMN1. Количество копий SMN2 варьирует от нуля до четырех на аллель, большее количество его копий более благоприятно. Также этот ген может быть мишенью терапии нусинерсеном (Спинраза) и рисдипламом (Эврисди) — оба препарата модулируют сплайсинг РНК SMN2. Однако у австралийского младенца была одна копия гена SMN1 с мутацией и всего одна копия гена SMN2 и, а у немецкого младенца — одна копия гена SMN1 с мутацией и ни одной копии SMN2.

Лаборатории, проводившие исследования, отнесли находки к вариантам неопределенного клинического значения (VUS). Ранее были описаны несколько пациентов со СМА, имевших мутации в близлежащих участках гена. Тем не менее у немецкого новорожденного не наблюдалось никаких симптомов; если бы у него не было функционального белка SMN, беременность закончилась бы выкидышем или мертворождением. Следовательно, изоформа белка, кодируемая геном с мутацией, должна обладать хотя бы остаточной функцией.

Авторы исследования провели функциональный, структурный и популяционный анализ, который позволил в итоге отнести оба обнаруженных варианта к непатогенным. Они создали лимфобластоидные клеточные линии от обоих детей, чтобы изучить сплайсинг белка. Неожиданно оказалось, что он не нарушен. Секвенирование по Сэнгеру ампликонов кДНК экзонов 5–8 выявило четкую последовательность полноразмерного транскрипта SMN1 у ребенка из Германии и различимые последовательности транскриптов SMN1 и SMN2 у ребенка из Австралии.

В то же время вестерн-блоттинг показал, что экспрессия белка у обоих детей резко снижена — его количество меньше, чем родственников детей и даже у пациентов со СМА типа IV. Термостабильность белка не изменилась по сравнению с диким типом, что говорит о потенциальной стабильности белка в организме. Анализ структуры концевого региона белка с помощью AlphaFold3 показал, что этот вариант не приводит к ее значительным изменениям.

Хотя обе делеции SMN1 снижали уровень экспрессии белка SMN, он действительно оставался функциональным. Авторы показали это в экспериментах с животной моделью СМА — рыбками данио, лишенными гена SMN1, которым вводили мРНК различных вариантов гена. (Об этом подходе авторы написали отдельную статью, опубликованную в декабре прошлого года.) Оказалось, что изоформы белка, кодируемые генами обоих детей, полностью компенсировали нарушение морфологии и двигательных функций. То же касалось и трансгенных рыбок, получивших ген с исследуемой мутацией.

Кроме того, исследователи провели поиск в базы данных gnomAD и выяснили, что эти варианты редки и встречаются исключительно у людей европейского происхождения. Все эти люди не имели симптомов СМА, и варианты у них присутствовали в гетерозиготном состоянии. Согласно расчетам авторов, в мире должно существовать около 800 носителей таких же вариантов гена SMN1 вместе с делецией, затрагивающей другую копию SMN1 (компаунд-гетерозигот). Но такое сочетание ни разу не было зарегистрировано у больных СМА, что подтверждает возможное протективное действие новых вариантов.

В итоге ни одному из пациентов не назначили лечение. Для младенца из Германии, у которого отсутствовали функциональные копии SMN2, единственной возможностью была генная терапия Золгенсма (онасемноген абепарвовек). Но поскольку в его организме все же присутствовала изоформа SMN, существовал риск иммунного ответа. Ребенку из Австралии могли быть назначены нусинерсен или рисдиплам, но при наличии одной копии гена SMN2 эффективность лечения была бы небольшой.

Тем не менее на момент подачи статьи в журнал обоим детям было два года, и оба демонстрировали нормальное моторное развитие. Принятое решение позволило избежать больших затрат на лечение — в общей сложности более 4 миллионов долларов США, отмечается в статье.

Ожидается, что в дальнейшем эти результаты будут учитываться в ходе скрининга новорожденных. Также они еще раз подчеркивают важность подтверждающего тестирования. не исключено, что дальнейшие исследование обнаруженной изоформы белка будут иметь терапевтическое значение. «Особенно интересен новый белок SMN, который позволил новорожденному из Германии выжить, несмотря на отсутствие SMN1 дикого типа, — отмечает Вирт, — и его следует проанализировать на протеомном уровне».

Введение препарата против СМА в амниотическую жидкость испытали на мышах