Ученые отредактировали митохондриальные гены у взрослых мышей

Новый способ позволил ученым из Кембриджа отредактировать митохондриальную ДНК у мышей. Для этого они доставили при помощи аденоасоциированного вирусного вектора редактор цитозиновых оснований на основе ДНК-дезаминазы в сердце мышей. Редактирование эффективно как для новорожденных, так и для взрослых животных. Однако остается проблема нецелевого редактирования.

Credit:
123rf.com

Митохондриальные заболевания относятся к генетическим расстройствам. Они встречаются примерно у 23 из 100 000 человек, что делает их одними из самых распространенных наследственных заболеваний. Эффективной терапии нет, и пациенты получают симптоматическое лечение. Ученые из Кембриджа опробовали на мышах новый метод редактирования митохондриальной ДНК для последующей возможной терапии подобных заболеваний.

Митохондрии играют центральную роль во многих ключевых метаболических путях. Большая часть митохондриального протеома кодируется геномной ДНК, однако 13 незаменимых полипептидов, а также 22 тРНК и две рРНК, необходимые для их трансляции, закодированы в кольцевой митохондриальной ДНК. Каждая клетка млекопитающих содержит от нескольких сотен до нескольких тысяч копий митохондриальной ДНК.

Митохондриальная ДНК млекопитающих оказалась устойчива к редактированию при помощи CRISPR/Cas-систем, потому что доставка нуклеиновых кислот в митохондрии крайне неэффективна. Для изучения функций митохондриального генома часто используются ферменты рестриктазы или программируемые нуклеазы. Последние применялись и для уничтожения неправильно функционирующих копий митохондриальных ДНК. В случае, если только часть находящихся в клетке копий несла вредные мутации, это помогало восстановить нормальных метаболизм in vitro и в in vivo моделях митохондриальных заболеваний. Однако программируемые нуклеазы не могут привнести новые варианты генов в митохондриальный геном.

В последнее время внимание ученых привлек новый инструмент для редактирования ДНК — редактор цитозиновых оснований на основе дезаминазы двухцепочечной ДНК (DdCBE). Этот фермент деаминирует цитозин до урацила, что способствует превращению Г-Ц пар в А-Т при последующей репликации.

Сначала ученые протестировали на клеточных культурах доставку DdCBE при помощи аденоасоциированных вирусных векторов. Они выбрали участок гена MT-Nd3, расположенного на митохондриальной ДНК, и спроектировали четыре варианта фермента, которые позволяли отредактировать кодирующий глицин кодон (GGA). Первый вариант показал высокую эффективность замены глицина на лизин (около 92,5%), и дальнейшие эксперименты проводили именно с ним.

На следующем этапе исследователи опробовали редактирование митохондриальной ДНК в соматических клетках мыши. Для этого редактор оснований доставляли в ткани животных при помощи вектора на основе аденоасоциированного вируса с повышенной тропностью к тканям сердца. Спустя три недели после инъекции препарата эффективность редактирования составила всего 1–2%. Через 24 недели доля отредактированных оснований составила уже 10–20%. При этом исследователи не заметили изменения в количестве копий митохондриальной ДНК в клетках по сравнению с контрольной группой.

Затем ученые проверили, усилит ли эффект редактирования ранняя доставка препарата. Для этого трансдукция была проведена через 24 часа после рождения мышат. Спустя три недели авторы работы зафиксировали 20–30% целевых замен.

Наконец, исследователи оценили нецелевую активность редактора оснований. У взрослых особей через 24 недели после инъекции количество нецелевых замен было в семь раз выше, чем у контрольной группы, а у новорожденных мышат спустя три недели после инъекции — в 21 раз выше. Чем эффективней прошло целевое редактирование, тем больше было нецелевых замен в митохондриальной геноме.

Таким образом, авторы работы показали, что доставка редакторов цитозиновых оснований может лечь в основу эффективной терапии генетических расстройств в митохондриальном геноме соматических тканей как у взрослых, так и новорожденных мышей. Однако, как отмечают ученые, для дальнейших исследований необходимо повысить специфичность редактирования.

Источник

Silva-Pinheiro P. et al. In vivo mitochondrial base editing via adeno-associated viral delivery to mouse post-mitotic tissue. // Nature 13, 750 (2022), published 8 February 2022. DOI: 10.1038/s41467-022-28358-w

Добавить в избранное

Вам будет интересно