Улучшенная донорная ДНК расширяет возможности CRISPR-Cas9

Система CRISPR-Cas9 индуцирует двунитевые разрывы ДНК. Она используется для нокаута генов, внесения точечных мутаций и нокинов (таргетных вставок известных последовательностей ДНК). Последние имеют большой потенциал для генной терапии, однако в человеческих клетках эффективность CRISPR-Cas9-опосредованных нокинов обычно не превышает 0,1%. Американские ученые нашли способ значительно повысить этот показатель.

Известно, что внесение фосфоротиоатных связей (замена одного кислородного остатка в фосфатной цепи на серу) в одноцепочечную донорную ДНК повышает частоту нокинов. Авторы новой статьи решили химически модифицировать концы двухцепочечной вставки. Они вносили фосфоторотиоатные связи или навешивали разные химические группы с 5’ и 3’-концов донорной последовательности. Ученые отмечают, что модифицировать 5’-конец довольно просто с помощью ПЦР, а изменение 3’-конца технически сложнее.

Всего проанализировали 13 вариантов модификаций. Проверку проводили на культуре клеток человеческого колоректального рака HCT116, используя репортерную нокин-систему для локуса GAPDH. Эффективность CRISPR-Cas9-опосредованных нокинов по механизму гомологичной рекомбинации повышалась в 2–5 раз в сравнении с немодифицированной системой. Более того, химическое изменение концов донорной ДНК позволило сократить длину плеч гомологии с 500 п. о. до 50 п. о.

Для дальнейших экспериментов авторы выбрали модификацию 5’ C6-PEG10 (к 5’-концу донорной ДНК через шестиуглеродный линкер присоединено 10 мономеров этиленгликоля) и проверили ее действие для разных клеточных культур и в разных генетических локусах и во всех случаях наблюдали увеличение доли нокинов. Так, для локуса lamin A/C клеток HEK293T процент успешных вставок немодифицированной донорной ДНК составил 30%, а введение 5’ C6-PEG10 увеличило долю до 65%. Кроме того, авторы протестировали возможность мультиплексного применения: репортерная система была успешно доставлена одновременно в локусы GAPDH и lamin A/C в клетках HEK293T.

Известно, что если нокин происходит посредством негомологичного соединения концов (NHEJ), в месте соединения возникают индел-мутации. Ученые показали, что модификация донорной ДНК для NHEJ-нокинов не увеличивает число инделов.

Авторы считают, что химические изменения концов донорной ДНК делают ее более стабильной и недоступной для клеточных ферментов. Повышение эффективности нокинов в клетках человеческих линий значительно расширяет возможности применения CRISPR-Cas9 как в исследовательских, так и в геннотерапевтических целях.