Уровень защиты от коронавируса определит конкурентный ИФА-тест

Исследовать иммунный ответ на коронавирусную инфекцию необходимо, чтобы понять прогноз пациента, оценить качество вакцины, определить, насколько защищен переболевший от повторного заболевания. Серологические ИФА-тесты обычно определяют антитела к S-белку коронавируса или его рецептор-связывающему домену. Можно ожидать, что если антитело распознает белок, необходимый вирусу для связывания с клеткой, оно окажется нейтрализующим. Тем не менее стопроцентной гарантии подобный тест не дает. Сегодня более 300 ученых и клиницистов опубликовали отчет о своих выводах и рекомендациях по серологическим исследованиям COVID-19. Они рекомендуют провести дополнительные исследования, чтобы определить, насколько можно быть уверенным, что человек с положительным тестом «на антитела» защищен от повторной инфекции SARS-CoV-2, и подчеркивают, что на существующем уровне понимания серологические тесты сами по себе не должны использоваться для принятия решений о личной безопасности.

Более надежным считается прямой метод — проверка, нейтрализует ли сыворотка крови переболевшего вирус SARS-CoV-2. Но для работы с опасным вирусом нужны соответствующие допуски, стабильная клеточная линия, чувствительная к инфекции. Можно вместо «настоящего» коронавируса использовать псевдовирусы, несущие белки SARS-CoV-2, но это также непросто. С другой стороны, когда в мире много выздоравливающих, важно быстро определить, у кого из них развился иммунный ответ, способный защитить от вируса. Поэтому необходим суррогатный диагностический метод, объединяющий простоту ИФА и надежность нейтрализации вируса.

Сотрудники Вистаровского института в Филадельфии и компании Inovio Pharmaceuticals разработали два подхода, которые определяют напрямую, а не косвенно, блокирует ли антитело связывание вируса с рецептором. Вистаровский институт и Inovio ведут совместную работу над ДНК-вакциной против коронавируса, которая сейчас проходит первую фазу клинических испытаний.

В основе первого подхода лежат метод конкурентного иммуноферментного анализа. В лунках планшета для ИФА иммобилизовали полноразмерный S-белок коронавируса. Для конкурентного ИФА сконструировали гибридный белок, состоящий из ACE2 — человеческого рецептора, с которым взаимодействует SARS-CoV-2, — и константных доменов иммуноглобулина, человеческого (такой белок авторы назвали huACE2-IgHu) или мышиного (huACE2-IgMu). В лунки с S-белком вносили раствор, содержащий исследуемую сыворотку и huACE2-IgHu. Если в сыворотке есть антитела, которые взаимодействуют с белком вируса так же, как человеческий рецептор, то количество связанного гибридного ACE2-белка уменьшается из-за конкуренции. Чтобы получить сигнал, систему инкубируют со вторичным антителом к ACE2-белку, несущим фермент пероксидазу хрена. Для исследования сывороток крови мелких животных, вакцинированных экспериментальными вакцинами, — мышей, морских свинок, кроликов — брали huACE2-IgHu и вторичное антитело к человеческим иммуноглобулинам, которое связывается с константным доменом. Для исследования сывороток низших приматов и человека — соответственно, huACE2-IgMu и вторичное антитело к мышиным иммуноглобулинам (см. рисунок).

Авторы отмечают, что характеристики сывороток, полученные в их исследовании, коррелируют с результатами, полученными методом нейтрализации псевдовируса.

Другой метод, который показывает, нарушает ли сыворотка взаимодействие между вирусом и рецептором, использует прибор для поверхностного плазмонного резонанса. В этом варианте вторичные антитела не требуются, поэтому не нужны модификации метода для разных биологических видов. На чипе с помощью однонитевой ДНК, биотина и стрептавидина иммобилизован рецептор-связывающий домен S-белка (RBD), с ним взаимодействует антитело в сыворотке (если оно там есть) либо ACE2. Результаты взаимодействия регистрирует прибор (Biacore 8K).

Оба теста позволяют быстро выявить антитела, блокирующие связывание S-белка с ACE2, как в сыворотке крови, так и в очищенных иммуноглобулинах. Авторы подчеркивают, что хотя они использовали ACE2, как основной рецептор для SARS-CoV-2, его при необходимости можно заменить на белок другого коронавируса.