В человеческой сетчатке обнаружили две популяции клеток с высоким регенеративным потенциалом

Дегенерация сетчатки — одна из основных причин слепоты по всему миру. К данной группе заболеваний относятся пигментный ретинит, макулярная дегенерация и врожденная дистрофия сетчатки — состояния, приводящие к необратимому повреждению нервной части сетчатки (НС) и/или ее пигментного эпителия (ПЭС). Современные подходы к лечению направлены на замедление разрушения и защиту оставшихся клеток сетчатки. Регенерации сетчатки можно добиться за счет ее стволовых клеток, однако считается, что у человека они обладают ограниченной потентностью, и это затрудняет такой метод лечения.

Известно, что сетчатка рыб и амфибий способна к регенерации за счет популяции плюрипотентных клеток на границе НС и ПЭС — в цилиарной краевой, или маргинальной зоне (ЦМЗ). Существование клеток с аналогичными свойствами у человека остается под сомнением — некоторые исследователи считают, что стволовые клетки сетчатки млекопитающих не способны дифференцироваться в клетки НС и дают начало исключительно клеткам ПЭС. В более поздних работах было показано, что они способны также к дифференцировке в клетки нервной части.

Группа ученых из Китая, используя метод мультиомиксного секвенирования (одновременный анализ ДНК и РНК) единичных ядер, выявила в сетчатке плода человека два кластера клеток со стволовыми свойствами. Образцы для анализа взяли на 21-й неделе развития. Клетки из первого кластера экспрессировали ассоциированные со стволовостью гены MECOM, COL9A1, RELN и PCDH7, а также гены CPAMD8, MEIS1 и TGFβ2, задействованные в развитии сетчатки. В клетках второго кластера экспрессировались другие ассоциированные со стволовостью гены — SLC6A15, MITF и PMEL, — а также маркеры зрелого ПЭС (CD96, BEST1). Анализ обогащения по функциональной принадлежности показал, что в клетках из первого кластера повышена активность генов, связанных с развитием нервной части сетчатки, пролиферацией нейрональных предшественников и дифференцировкой фоторецепторов, а в клетках из второго кластера — генов, задействованных в пролиферации эпителиальных клеток и пигментации. Авторы обозначили клетки первого кластера как hNRSC (стволовоподобные клетки человеческой нейральной сетчатки), а клетки второго кластера как стволовоподобные клетки ПЭС.

Траектории дифференцировки клеток авторы подтвердили, оценивая соотношение сплайсированных и несплайсированных мРНК (RNA velocity). Выяснилось, что hNRSC способны дифференцироваться в прогениторные клетки сетчатки, предшественники фоторецепторов и затем фоторецепторы, а стволовоподобные клетки ПЭС — в клетки пигментного эпителия. Также было продемонстрировано, что транскрипционные факторы MECOM, TBX20, THRB и ESRRG специфичны для hNRSC и регулируют экспрессию многочисленных генов, задействованных в формировании синапсов, развитии аксонов и других процессов, необходимых для формирования НС.

Чтобы определить локализацию hNRSC и стволовоподобных клеток ПЭС, исследователи провели пространственную транскриптомику тканей глаза, полученных от плода на 19 неделе развития. Они установили, что hNRSC располагаются в периферических отделах сетчатки в пределах ЦМЗ. В этой же области были обнаружены стволоподобные клетки ПЭС. Изолированные при помощи проточной цитометрии hNRSC in vitro демонстрировали высокую способность к формированию клональных сфер и дифференцировке в ганглиозные клетки сетчатки, горизонтальные, амакриновые, биполярные и фоторецепторные клетки.

Культивируя органоиды человеческой сетчатки, ученые заметили, что в большинстве случаев в них образуются ЦМЗ-подобные структуры, причем такие органоиды демонстрируют лучшую выживаемость in vitro. Они предположили, что данные структуры обеспечивают регенеративный потенциал. Используя человеческие эмбриональные стволовые клетки, исследователи создали органоиды сетчатки, в которых прогениторные клетки сетчатки и биполярные клетки были помечены флуоресцентным белком. Это позволило пронаблюдать, как после удаления НС из органоидов происходило полное восстановление этого участка. В органоидах без ЦМЗ-подобных структур регенерации не происходило. Сам процесс регенерации визуализировали с помощью добавления в среду EdU, меченного аналога тимидина, способного встраиваться в ДНК активно делящихся клеток. Дальнейший транскриптомный анализ и изучение морфологии органоидов подтвердили, что восстановление НС повторяет ход ее нормального развития, а полученные структуры идентичны таковым до повреждения. В дальнейшем было показано, что в ЦМЗ-подобных структурах присутствуют hNRSC, аналогичные клеткам из «настоящей» сетчатки.

Чтобы подтвердить регенеративные свойства hNRSC in vivo, ученые пересадили клетки, выделенные из ЦМЗ-подобных структур органоидов, мышам, служащим моделью дегенерации сетчатки. Спустя 12 недель после трансплантации клетки встроились в сетчатку и экспрессировали маркеры фоторецепторов, а через 20 недель обнаружилось также формирование синапсов с клетками реципиента. С помощью скотопической электроретинографии и оптокинетического теста авторы подтвердили восстановление биоэлетрической активности сетчатки и способности мышей видеть. Жизнеспособность клеток трансплантата сохранялась не менее 24 недель после пересадки. Что особенно важно, трансплантация hNRSC не приводило к развитию опухолей у мышей-реципиентов.

Результаты данного исследования могут стать основой использования hNRSC для лечения слепоты, связанной с дегенерацией сетчатки. В перспективе этот метод может рассматриваться как эффективный и безопасный благодаря способности hNRSC к пролиферации, дифференцировке и формированию контактов с сохранившимися клетками сетчатки, а также их низкой иммуно- и онкогенности.

Генная терапия наследственной дистрофии сетчатки улучшила адаптацию глаз пациентов к темноте