Время синтеза олигонуклеотидов удалось сократить на часы

Автоматизированный синтез нуклеотидов — основа производства праймеров для ПЦР и олигонуклеотидных лекарств. В качестве предшественников нуклеотидов используются фосфорамидиты (моноамиды диэфиров фосфористой кислоты) нуклеозидов. Ученые из Дании предложили новый быстрый метод получения фосфорамидитов, исключающий стадию их хранения.

Синтеза фосфорамидитов нуклеозидов до сих пор проводится по протоколу, разработанному в 1981 году. При этом используются фосфитилирующие реагенты: хлорфосфорамидит (PCl) или фосфородиамидит (PN). Время реакции составляет 1–5 часов, затем следует стадия очистки. Весь цикл, от начала синтеза фосфорамидитов до запуска их в производство олигонуклеотидов, занимает не менее 12 часов. Кроме того, фосфорамидиты нужно хранить в инертной атмосфере при −20°C, чтобы минимизировать окисление и гидролиз. Однако на практике фосфорамидиты приходится держать в синтезаторах ДНК/РНК при температуре окружающей среды. В таких условиях они легко деградируют.

Авторы новой работы иммобилизовали PCl или PN и их активаторы на твердой подложке, состоящей из полимерной смолы. При таком подходе упрощается процесс очистки: фосфорамидиты легко элюируются с подложки при помощи спирта, а побочные продукты остаются иммобилизованными. Кроме того, можно фосфитилировать нуклеозиды непосредственно перед синтезом олигонуклеотидов.

Ученые интегрировали реакцию на подложке в проточную систему, роль которой выполняла колонка для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Через колонку пропускали нуклеозиды, которые всего за 6 минут конвертировались в фосфорамидиты на 98%. С помощью такой системы ученые получили цепочку из 51 нуклеотида (все четыре канонических нуклеотида были задействованы). Выход реакции с готовыми фосфорамидитами составил 98%, общий выход — 35,2%. Для традиционного метода синтеза олигонуклеотидов с использованием коммерчески доступных фосфорамидитов эти показатели составили 98,3% и 41,8% соответственно. Чистота полученных олигонуклеотидов практически не различалась.

Авторы считают, что в перспективе разработанный ими метод будет интегрирован в автоматические синтезаторы нуклеиновых кислот, что значительно сократит общее время синтеза. Однако на данном этапе метод больше подходит для синтеза дорогих и нестабильных соединений. Для широкомасштабного производства будет необходима более тщательная очистка продуктов.