Вычислительный метод xPore определяет модифицированные основания после нанопорового секвенирования РНК

Существует более 100 химических модификаций РНК. Они влияют на некоторые посттранскрипционные процессы, включая деградацию и трансляцию мРНК, сплайсинг пре-мРНК и первичный процессинг микроРНК. Нарушения в модификациях ассоциированы с различными заболеваниями. Существующие экспериментальные методы обнаружения модификаций РНК, таких как N⁶-метиладенозин (m⁶A), имею ряд ограничений. Так, прямое нанопорное секвенирование РНК способно идентифицировать модификации РНК за счет регистрации вызванных ими систематических сдвигов сигнала от нанопоры. Но оно не позволяет количественно определить уровень модификаций.

Чтобы решить эту проблему, группа ученых из Сингапура разработала вычислительный метод и статистическую схему xPore, которая анализирует данные нанопорового секвенирования РНК. xPore устраняет необходимость в контрольном образце РНК без модификаций и позволяет определить долю модифицированных оснований в образце.

Для валидации метода использовали клетки HEK293T дикого типа и клетки с нокаутом METTL3, которые не имеют m⁶A. Модификацию m⁶A метод xPore определял с разрешением в один нуклеотид.

Также синтезировали РНК с заранее известными средними уровнями модификации m⁶A. xPore верно определял уровень при модификации 25%, 50%, 75% или 100% всех аденинов.

Затем ученые применили метод к данным прямого секвенирования РНК шести клеточных линий: HEK293T с нокаутом METTL3, а также клеток раков печени (HEPG2), кишечника (HCT116), молочной железы (MCF7), легочной аденокарциномы (A549) и лейкемии (K562). Авторы идентифицировали от 800 до 2000 дифференциально модифицированных сайтов. Таким образом, xPore работает на клетках различных генетических линий. Некоторые сайты совпадали, но средний уровень модификаций обычно различался.

Также проанализировали результаты РНК-секвенирования образцов трех пациентов со множественной миеломой, используя только 5% рекомендованного количества РНК. И в этих условиях удалось определить основные дифференциально модифицированные сайты.

«Поскольку прямое секвенирование РНК становится все более широко доступным, мы предполагаем, что анализ модификаций может дополнить анализ дифференциальной экспрессии и дать представление о сложном ландшафте модификаций РНК и их роли в заболеваниях», — пишут исследователи.