Выявлен возможный механизм развития диареи при ротавирусной инфекции

Липидные капли (lipid droplets, LD) в настоящее время признаны динамическими внутриклеточными органеллами, участвующими в различных биологических процессах, таких как мембранный транспорт, передача сигналов, модуляция иммунных и воспалительных реакций. Они имеют гидрофобное ядро из нейтральных триацилглицеринов (ТАГ, TAG) и эфиров холестерина, окруженное монослоем из фосфолипидов, который содержит поверхностные белки, регулирующие липидный метаболизм. На заключительной стадии синтеза ТАГ образуются из диацилглицерина (DAG) и ацил-КоА с помощью локализованных на ЭПР ферментов — DAG-ацилтрансфераз (DGAT1 и DGAT2). У людей в кишечнике экспрессируются только один из этих ферментов — DGAT1. У пациентов с двумя мутантными копиями DGAT1 развивается хроническая диарея и другие симптомы, часто приводящие к гибели.

Ротавирусы (РВ), вызывающие тяжелый дегидратирующий гастроэнтерит у маленьких детей, используют LD для образования вироплазм. Внутри этих структур происходит репликация вируса и сборка незрелых частиц. Они состоят как из вирусных, так и из клеточных белков, ассоциированных с компонентами LD. Для образования вироплазм необходимо взаимодействие двух неструктурных белков ротавируса — NSP2 и NSP5. Механизмы биогенеза LD, которые ротавирус использует для формирования вироплазм, не ясны. Также не изучена роль изменения липидного обмена при диарее, вызванной ротавирусами. Есть основания полагать, что нарушение работы эпителия, вызванные ротавирусом, связаны с уровнем DGAT1, но доказательств до этого момента не было.

Специалисты из Медицинского колледжа Бэйлора (США) изучили, каким образом биогенез LD и уровень DGAT1 влияют на репликацию ротавируса и патогенез инфекции. Для этих исследований они использовали хорошо зарекомендовавшую себя модель ротавирусной инфекции на клетках почек обезьян (MA104), а также полученные из стволовых клеток кишечные энтероиды человека (human intestinal enteroids, HIE). Результаты работы они опубликовали в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences.

С помощью конфокальной микроскопии исследователи визуализировали вироплазмо-зависимые неструктурные белки NSP2 и NSP5 и LD-ассоциированный белок PLIN1. Для обнаружения LD они использовали LipidTOX, краситель, который имеет чрезвычайно высокое сродство к нейтральным липидам. Вироплазмы колокализовались с PLIN1 и нейтральными липидами. Затем ученые исследовали, когда синтезируются нейтральные липиды, обнаруженные в вироплазмах. Они использовали флуоресцентно меченную додекановую кислоту BODIPY 558/568 C12, аналог жирной кислоты, который включается в молекулы нейтральных липидов, и выяснили, что ТАГ в составе вироплазм синтезировались и накапливались в клетке до инфицирования. Во время инфекции клетки продолжали поглощать жиры и вырабатывать новые LD, которые, тем не менее, не были ассоциированы с вироплазмами.

Существуют две формы белка NSP2, которые различаются по времени появления, конформации и локализации в клетках, инфицированных ротавирусом: диспергированная NSP2 (dNSP2) и ассоциированная с вироплазмой NSP2 (vNSP2). Поскольку превращение DAG и ацил-КоА в ТАГ с помощью DGAT1 является лимитирующей стадией синтеза ТАГ, ученые оценили, взаимодействует ли этот фермент с dNSP2 или vNSP2. Иммунопреципитация и вестерн-блот показали, что DGAT1 взаимодействует вместе с dNSP2, но не с vNSP2. В клетках, нокаутированных по DGAT1, образование вироплазм происходило раньше по сравнению с контролем. Также был значительно увеличен процент клеток, содержащих вироплазмы, и количество вироплазм на клетку, а выход вирусного потомства возрос в четыре раза. То есть взаимодействие dNSP2 с DGAT1 не вызывает формирование вироплазм/LD. Вероятно, отсутствие DGAT1 может способствовать отпочковыванию LD.

Исследователи предположили, что ротавирус управляет уровнями DGAT1. Они обнаружили, что уровни DGAT1 снижаются по мере увеличения количества вирусного белка NSP2 в клетке во время инфекции. Путем добавления к культуре MA104 ингибитора протеасом MG132 они определили, что DGAT1 разрушается по протеосомно-зависимому механизму. При этом DGAT1 взаимодействует с полиубиквитинированным dNSP2. Опосредованная ротавирусом деградация DGAT1 приводит к фенотипу, схожему с фенотипом людей, мутантных по DGAT1.

Отсутствие DGAT1 было ассоциировано с потерей ключевых белков щеточной каймы на апикальной поверхности энтероцитов (сахараза-изомальтаза, ионного транспортера NHE3, виллина, эзрина и E-кадгерина). Известно, что фосфорилированный eIF2α (P-eIF2α) ингибирует глобальную клеточную трансляцию. Чтобы определить механизм снижения экспрессии клеточных белков, ученые оценили, фосфорилируется ли фактор инициации трансляции eIF2α в инфицированных клетках. В HIE, нокаутированных по DGAT1, уровень P-eIF2α был увеличен, что может быть механизмом снижения экспрессии белков, приводящей к развитию диареи.

Таким образом, ученые предполагают, что при ротавирусной инфекции происходит деградация DGAT1 посредством взаимодействия с полиубиквитинированным dNSP2, и это проливает свет на новую функцию этого неструктурного вирусного белка. Подавление DGAT1 приводит к раннему образованию большого количества вироплазм, а также к увеличению выхода вируса. Ранее считалось, что ротавирусная диарея связана с потерей энтероцитов. Однако полученные в данной работе результаты показывают, что именно деградация DGAT1, опосредованная dNSP2, вызывает снижение экспрессии белков, необходимых для нормальной функции энтероцитов. Исследователи выдвинули гипотезу, что за потерю переносчиков ионов и соединительных белков, необходимых для нормального гомеостаза энтероцитов, ответственно глобальное снижение клеточной трансляции вследствие повышенного фосфорилирования фактора eIF2α.

МД-2023: Инфекции желудочно-кишечного тракта