Выявлены новые субгеномные РНК коронавируса

Международная группа исследовала пул субгеномных РНК SARS-CoV-2 с помощью недавно разработанного метода нанопорового секвенирования NRCeq. Этот метод учитывает только те РНК, на 5’-конце которой присутствует кэп. Результаты исследования опубликованы в виде препринта. Авторы подтвердили существование канонической субгеномной РНК ORF10, а также выявили новую каноническую субгеномную РНК — ORF9d.

Credit:
123rf.com

Геном коронавируса представлен (+)-цепью РНК длиной приблизительно 30 т.п.н. На 5’-конце цепи расположен нетранслируемый регион, в который входит лидерная регулирующая транскрипцию последовательность TRS-L. После этого идут две большие рамки считывания — ORF1a и ORF1b, кодирующие неструктурные белки, а за ними — множество небольших ORF, кодирующих структурные и вспомогательные белки. Перед каждой ORF, кроме ORF1ab, расположена регулирующая транскрипцию последовательность TRS-B, гомологичная TRS-L. ORF1ab транслируются прямо с генома коронавируса, чтобы собрать комплекс регуляции-транскрипции (RTC). Остальные ORF транслируются с субгеномных РНК, которые синтезируются RTC через (-)-интермедиаты.

Во время синтеза (-)-интермедиатов RTC может перескакивать на разные TRS-B. Таким образом, TRS-L сливаются с TRS-B и ORF, идущими за ней. В результате образуется пул частично перекрывающихся субгеномных РНК, состоящих из (-)-цепей длиной от 200 до 8000 нуклеотидов и более. На их основе синтезируются (+)-цепи субгеномных РНК, с которых транслируются белки. На 5’-конце этих РНК находится кэп; они полиаденилированы на 3’-конце (смотреть рисунок). В настоящее время о субгеномных РНК мало известно, а их изучение сопряжено с рядом трудностей. В частности, нельзя отличить целые транскрипты от фрагментов РНК. Для прояснения этих вопросов международная группа ученых применила новый метод нанопорового секвенирования — Nanopore ReCappable Sequencing (NRCeq). Результаты размещены в базе bioRxiv.

В рамках метода NRCeq 5’-кэп РНК (m7Gppp-РНК) удаляют с сохранением на 5’-конце РНК остатка пирофосфата, к которому затем добавляют адаптер. При секвенировании учитывают лишь те молекулы, в которых присутствует этот адаптер.

Метод позволил отличить истинные мРНК от фрагментов и артефактов. Всего достоверно была выявлена 21 субгеномная РНК, 14 из которых — канонические. У канонических субгеномных РНК начало совпадает с 5’-концом генома, они содержат по крайней мере 40 нуклеотидов из 5’-нетранслируемого региона, их 3’-конец совпадает с 3’-концом геномной РНК, они содержат регион с по крайней мере 66%-ной схожестью с каноничной последовательностью TRS-B.

Помимо описанных ранее канонических субгеномных РНК, обнаружена также субгеномная РНК ORF10, о существовании которой велись споры, а также новая каноническая субгеномная РНК ORF9d. РНК, содержащая ORF10, — самая короткая из канонических субгеномных РНК SARS-CoV-2. ORF9d представляет собой усеченную версию РНК, кодирующей N-белок. Не была детектирована субгеномная РНК, соответствующая ORF7b. Авторы предполагают, что считывание ORF7b происходит с ORF7a, и не исключают вероятности, что такая РНК экспрессируется на низком уровне и не может быть детектирована этим методом.

Остальные семь субгеномных РНК, существование которых удалось показать с высокой степенью достоверности, являются неканоническими: одна из них не содержит канонического 3’-участка, а остальные шесть не содержали участка слияния TRS-L/TRS-B. Эти неканонические субгеномные РНК экспрессируются на низком уровне.

Профиль субгеномных РНК оказался консервативным при заражении разных клеточных линий — CaCo2, Vero и CaLu3, несмотря на различный титр вируса в них.

Впервые был изучен пул кэп-содержащих субгеномных РНК коронавируса, и эта информация будет полезна для дальнейших исследований транскрипции и трансляции у коронавируса.

Источник

Ugolini C. et al. Nanopore ReCappable Sequencing maps SARS-CoV-2 5′ capping sites and provides new insights into the structure of sgRNAs // bioRxiv, 2021; DOI: 10.1101/2021.11.24.469860.

Добавить в избранное

Вам будет интересно