Алёна Макарова: «Белки не выделяются, гели рвутся, повторности не сходятся, гипотезы не подтверждаются»

Мы предложили модель праймазной активности полимеразы PrimPol, подготовили публикацию и сейчас отправили в журнал Nucleic Acids Research. (Статья доступна как препринт.) Это важный результат, а история следующая. У человека описано более 15 ДНК-полимераз. Наша лаборатория изучает специализированные ДНК-полимеразы, которые важны для репарации и репликации поврежденной ДНК. Эти ферменты защищают клетки от гибели из-за остановки репликации в поврежденных участках, а также от мутагенеза и канцерогенеза.

Долгое время считалось, что все ДНК-полимеразы человека требуют затравки, чтобы начать синтез ДНК. Но в 2013 году впервые была описана новая ДНК-полимераза, которая одновременно является ДНК-праймазой, то есть она синтезирует ДНК de novo, используя ДНК-праймеры. В отличие от праймеров, синтезированных РНК-праймазой, их не нужно потом удалять из геномной ДНК, что очень удобно. Оказалось, что этот фермент, PrimPol, важен для репликации поврежденной ДНК.

Мы стали ее исследовать. В 2019 годы мы сотрудничали с лабораторией профессора Таира Таирова в Омахе (UNMC, США), чтобы получить комплекс полноразмерной PrimPol с ДНК и расшифровать ее структуру. Лаборатория профессора Таирова — ведущая группа по кристаллографии ДНК-полимераз в мире. Но у нас ничего не получилось. Мы выделили более 20 мутантных вариантов белка, испробовали разные типы ДНК и модификации нуклеотидов, но так и не смогли получить стабильный комплекс и кристаллы. И не только у нас не получилось, несколько групп в мире много лет работают над этой проблемой (из Испании, Англии и США), но удается закристаллизовать только часть молекулы… В 2020 и 2021 мы не могли ездить в командировки из-за ковидных ограничений, а в 2022-м физически не смогли записаться на визу. Но мы смогли очень много узнать о механизме праймазной активности с помощью биохимических исследований.

Оказалось, что по механизму работы он очень похож на РНК-праймазу человека, хотя это односубъединичный фермент, а не двухсубъединичный, как РНК-праймаза.

Первый инициаторный нуклеотид — это обычный аденозинтрифосфат, АТФ. Мы показали, что PrimPol связывает трифосфатную группу АТФ, и она необходима для образования стабильного комплекса белка с ДНК. С помощью сайт-направленного мутагенеза мы обнаружили аминокислотные остатки, связывающие АТФ, а коллеги из США подтвердили биохимические данные с помощью моделирования структуры PrimPol. Комплекс полноразмерной PrimPol с ДНК не получался, потому что искусственно синтезированная ДНК лишена трифосфатной группы. А если дать ДНК с трифосфатом, то, наверное, структура получится.

Меня в последнее время впечатлили работы, которые не связаны с нашей областью исследований — быстрая разработка эффективных противовирусных таргетных препаратов для лечения Covid-19. Паксловид, молнупиравир… И перепрофилирование платформы мРНК для создания вакцин для профилактики инфекционных заболеваний — то, что сделали «Модерна» и «Пфайзер». Быстро и эффективно.

Основная проблема в современной молекулярной биологии в России банальна — сложности с закупкой реактивов и оборудования. Об этом уже много сказано. Если в Европе и США реактивы можно купить в течение недели, то у нас на это уходят месяцы. К сожалению, ситуация не улучшается, а в этом году из-за санкций и нарушения цепей логистики она значительно ухудшилась. В этом году мы не смогли купить сразу несколько реактивов, что отразилось на нашей работе. Мне кажется, что решения у проблемы есть: поддержка российских компаний, которые производят реактивы и предлагают услуги в области молекулярной биологии, упрощение процедуры таможенного оформления ввоза реактивов и оборудования. Отмена таможенных пошлин на оборудование.

Мы планируем закупки на несколько месяцев вперед, чтобы всегда был запас. Иногда делаем закупки одного и того же реактива сразу у нескольких компаний. Если не смогли купить, тогда откладываем эксперименты. Ищем у коллег.

После реорганизации Российский фонд фундаментальных исследований перестал выполнять функцию значимого фонда поддержки проектов в области биологии. РНФ пока не покрывает все проекты, которые поддерживал РФФИ. Прежде всего это проекты малых групп — небольшие деньги, но их может получить большое количество исследований! Это важно для новых стартовых проектов, по которым нет научного задела, это важно для молодых ученых. Это важно для рисковых проектов, когда ты точно не уверен, что получишь тот результат, который описал в заявке гранта. В РФФИ не было таких строгих требований по публикациям, как в РНФ. В РФФИ был замечательный конкурс поддержки аспирантов, в РНФ такого нет. А это очень мотивирует, когда аспирант получает свой первый грант.

Беспокоит нарастающая оторванность российской науки. Современная наука — это всегда очень высокоспециализированные исследования. В каждой области есть несколько сильных групп, которые работают над одной проблемой в разных странах. Не всегда это конкурирующие лаборатории, часто исследования дополняют друг друга: используют разные модельные объекты и методы исследования. Международные группы сотрудничают, и это позволяет добиваться максимально высоких результатов. Очень важно, чтобы ученые в России сохранили связи с коллегами за рубежом, возможность посещать международные конференции, обмениваться идеями. Важно, чтобы сохранилась возможность публикации в международных журналах. Очень важно сохранить интеграцию российской науки в мировую. Нужно максимально поддерживать (насколько это возможно в текущих условиях) международные проекты и сотрудничество. Причем со всеми странами, не деля их на «дружественные» и «недружественные». Нужно поощрять публикации в международных журналах. Если это международный журнал первого квартиля, то он засчитывается за две публикации — вот это обязательно. Выделять деньги на посещение международных конференций…

Политическая ситуация пока не отражается на текущих проектах нашей лаборатории.

В долгосрочной перспективе сейчас стало сложно загадывать, горизонт планирования сократился. В краткосрочной — сейчас в лаборатории идет интенсивная защита диссертаций. В сентябре-октябре в нашей молодой лаборатории защитились первые два аспиранта, а в ноябре я представила докторскую к защите (предзащита). В будущем мы планируем переходить к исследованию ДНК-полимераз, которые наиболее сложно выделить и сложно исследовать. Также мы хотим оторваться от биохимии в пробирке и развивать исследования ДНК-полимераз в клетках. Сейчас мы получаем культуры клеток с нокаутами генов разных ДНК-полимераз человека как инструменты для исследования их функций.

Мы проводим фундаментальные исследования, но с практической точки зрения ДНК-полимеразы важны для защиты от повреждений ДНК. Если повреждение блокирует высокоточные репликативные ДНК-полимеразы, это приводит к гибели клеток, апоптозу. И многие ДНК-полимеразы специализируются на репликации и репарации разных типов повреждений ДНК, но синтезируют ДНК с низкой точностью и сами могут являться источником мутаций. И эти специализированные ДНК-полимеразы описаны не так давно, в 2000-х. Их функции недостаточно исследованы, нокаут одной из ДНК-полимераз не всегда приводит к значимому эффекту, нужно изучать двойные, тройные нокауты… Очень важно, чтобы в клетке была правильная регуляция активности специализированных ДНК-полимераз. В нужном месте и в нужное время нужно детектировать повреждение, выбрать «правильную» ДНК-полимеразу и включить напротив повреждения правильный нуклеотид и возобновить репликацию без мутаций.

Одно из последних направлений исследований — участие ДНК-полимераз в развитии устойчивости к препаратам химиотерапии. Многие препараты направлены на блокировку деления клеток с помощью повреждения ДНК, например, цисплатин. Специализированные ДНК-полимеразы помогают опухолевой клетке избежать гибели из-за повреждений ДНК.

Через 20–50 лет исследования в области ДНК-полимераз найдут применение в медицине. В 2022 году впервые один из ингибиторов специализированной ДНК-полимеразы дошел до стадии клинических исследований. Я думаю, что таких исследований будет все больше.

Общее правило, которое относится не только к науке и молекулярной биологии, — делать то, что тебе нравится, выбрать ту профессию, которая тебе по душе. А начинающим исследователям я бы посоветовала никогда не расстраиваться при первых неудачах и не бояться сложностей. Часто студенты и некоторые аспиранты представляют себе научную работу молекулярного биолога в лаборатории очень идеализированно. Им кажется, что достаточно сделать два-три эксперимента, чтобы получить серьезные результаты, а через два года можно ожидать открытие мирового уровня. Но реальность, как правило, совсем другая. Белки не выделяются, гели рвутся, повторности не сходятся, гипотезы не подтверждаются, или, наоборот, получаются неожиданные результаты, которые потом помогают сделать новые открытия и предложить, создать новые гипотезы. Важно, чтобы экспериментатор обладал упрямством. Нужно быть готовым к тому, что отработка новой методики или выделение нового белка может занять несколько месяцев, а иногда и несколько лет.