Анастасия Снежкина: «NEB позволяет работать с малыми количествами материала»

В 2019 году, еще до пандемии, в рамках Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий началось создание геномных центров мирового уровня. Месяц назад опубликован перечень поручений президента Правительству РФ, который открывается призывом «обеспечить расширение научно-практических исследований, направленных на расшифровку (секвенирование) геномов циркулирующих в Российской Федерации и в мире возбудителей инфекционных болезней, и финансирование указанных исследований».

PCR.NEWS продолжает беседовать с российскими учеными о современных реактивах и оборудовании для молекулярно-биологических исследований, устойчивом развитии компаний, совершенствовании и модернизации. В конце 2020 года мы рассказали о первом в России нанопоровом секвенаторе третьего поколения PromethION 24. Сейчас мы расскажем о наборах для подготовки библиотек для секвенирования от компании NEB.

Американская компания New England Biolabs (NEB) производит реагенты для исследований в области молекулярной биологии. В ее портфолио — эндонуклеазы рестрикции, реагенты для клонирования, ПЦР/ОТ-ПЦР/реал-тайм ПЦР, NGS-пробоподготовки, редактирования генома, выделения и очистки НК, экспрессии белков, клеточного анализа, гликобиологии.

Эксклюзивный дистрибьютор продукции New England Biolabs в России и СНГ —компания SkyGen.

О наборах NEBNext для подготовки библиотек РНК рассказывает Анастасия Снежкина — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН и Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, а также сотрудник ЦКП «Геном» (Москва). Анастасия — лауреат премии Правительства Москвы 2017 года и лауреат программы L'ORÉAL-UNESCO «Для женщин в науке» 2020 года. Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины на базе ИМБ РАН — один из трех центров, созданных в 2019 году в рамках нацпроекта «Наука».

Анастасия Снежкина

Анастасия, как давно вы работаете с реагентами NEB?

Мы познакомились с реагентами NEB около 2015 года. Мы очень долго работали с наборами фирмы Illumina, но когда в России стали появляться наборы других фирм, начали их пробовать. Попробовали много, NEB нам понравился. Понравился и выход, и протокол, и техническая поддержка. Сейчас Illumina и NEB — две основные фирмы, которыми мы пользуемся.

Для каких целей вы используете наборы NEB?

Мы делаем очень много транскриптомных библиотек. Для подготовки библиотек мРНК мы используем NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit, для подготовки библиотек микроРНК – NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit. Эти наборы адаптированы для секвенирования на платформе Illumina.

Что-то докупаете отдельно, помимо того, что входит в набор?

К набору для подготовки библиотек мРНК, помимо основной части, приобретается модуль для обогащения фракции мРНК, чтобы вытягивать мРНК за поли(А)-хвост. Отдельно, также у NEB, мы покупаем индексы для мультиплексирования, чтобы можно было смешивать несколько образцов и секвенировать их одновременно. Что касается наборов для подготовки библиотек микроРНК, у NEB есть два варианта: набор, к которому отдельно необходимо покупать индексы, и недавно вышедший набор, сразу включающий 48 индексов для мультиплексирования, которым мы пользуемся. Также как и для большинства наборов других фирм, к наборам NEB мы докупаем магнитные частицы и колонки для очистки фрагментов ДНК, колонки для экстракции микроРНК из геля и общелабораторные реагенты.

Как выглядит протокол подготовки библиотеки?

Касательно мРНК — сначала из тотальной РНК вытягиваем мРНК за поли(А)-хвост, потом фрагментируем, праймируем, синтезируем первую и вторую цепь кДНК. Дальше из очищенной кДНК подготавливаются библиотеки: происходит репарирование концов, 3’-аденилирование, лигирование адапторов, обогащение фрагментов ДНК с помощью ПЦР, затем проводится количественная и качественная оценка подготовленных библиотек. (Подробнее о протоколе можно прочитать здесь. — PCR.NEWS).

Для мРНК мы протокол в основном не модифицируем. А вот для микроРНК — немного изменяем, в зависимости от входящего материала. На вход может браться различное количество тотальной РНК, и в зависимости от него ставиться большее или меньшее количество циклов ПЦР, это мы подбираем эмпирически.

Как вы оцениваете время и усилия, которые уходят на пробоподготовку?

В этом отношении все наборы для подготовки транскриптомных библиотек сейчас похожи. У NEB стандартный протокол, и, мне кажется, время оптимально. В целом, у наборов NEB довольно быстрая подготовка, но даже отличие на плюс-минус час для нас не играет особой роли. Мы не делаем за неделю тысячу образцов. Эксперимент планируется заранее и отводится время, чтобы качественно сделать библиотеки и потом не переделывать. С РНК нужно очень осторожно работать, торопиться не стоит. Мы часто работаем с незнакомыми нам образцами, поэтому бывает так, что сначала берем всего несколько штук, чтобы попробовать сделать из них библиотеки, оценить их качество и количество. Образцы ценные, стоимость подготовки библиотек высокая, поэтому лучше два дня потратить на то, чтобы сделать, например, два «пробных» образца, и потом, если эти образцы получились и все нас устраивает, уже взять партию больше.

И конечно, количество времени для подготовки зависит от материала и количества образцов. Один образец можно довольно быстро сделать, а если берется 24 или 96 образцов, то время подготовки намного увеличивается. Я бы сказала, что оптимальное время для подготовки транскриптомных библиотек из 24 образцов — это два-три рабочих дня с учетом времени последующей их оценки.

А выход РНК-библиотек хороший?

Что касается наборов для подготовки библиотек из мРНК, выход действительно большой. Конечно, есть требования к входящей РНК — она должна быть свободной от солей, спиртов, ионов магния, обработана ДНКазой, показатель качества РНК (RIN) должен быть высокий. Концентрация должна быть достаточно высокой: чем ниже концентрация входящей РНК, тем меньше будет выход библиотек. При соблюдении всех условий выход хороший. Например, мы делали библиотеку из опухолевого материала, получилось 65 нанограммов на микролитр — это очень много. Столько для секвенирования даже не нужно, концентрация библиотек для запуска находится в диапазоне наномолей.

А вот по микроРНК разговор отдельный. На последнем этапе подготовки вся библиотека разгоняется на геле, и из геля вырезается фрагмент длиной примерно 145 пар нуклеотидов. Библиотека микроРНК экстрагируется из геля, потом осаждается. Это удлиняет процесс подготовки и влияет на выход. Да и самой фракции микроРНК в образце немного. Но мы любим наборы NEB, потому что они позволяют работать со сложными образцами. Мы работаем с микроРНК, выделенной из плазмы крови и экзосом, и используем набор NEB для подготовки библиотек из этого материала. Когда из плазмы выделяется тотальная РНК, иногда даже сложно померить ее концентрацию. Но наборы NEB позволяют обогатить фракцию микроРНК и получить количество, достаточное для запуска. Например, для образцов из плазмы мы получали до 1,5 нанограммов на микролитр библиотек, этого достаточно для секвенирования. Если подготавливать библиотеки из микроРНК, выделенной из тканей, — например, опухолевых образцов, — то можно получить до 4 нанограммов на микролитр.

Что можно сказать о качестве секвенирования?

Так как мы довольно долго работаем в области секвенирования, мы понимаем, какие образцы нам лучше подготавливать с использованием наборов NEB, а какие с помощью наборов других фирм. NEB отлично справляется со сложными образцами с низкой входящей концентрацией тотальной РНК. Например, мы с помощью набора NEB подготавливали библиотеки микроРНК из образцов опухолей FFPE (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded — образцы, зафиксированные формалином и залитые парафином. — PCR.news.). У нас получилось. Понятно, что РНК в этих образцах деградирована (что также было видно по результатам секвенирования), но NEB в принципе позволил подготовить из них библиотеки. Качество секвенирования библиотек с использованием наборов NEB всегда хорошее.

Можно ли с их помощью подготовить библиотеки из единичных клеток?

Подготовку библиотек из единичных клеток с использованием наборов NEB мы не проводили. Но, как я уже говорила, NEB позволяет работать с малыми количествами материала на входе. Например, был случай, когда мы работали с образцами плазмы крови пациентов, больных раком предстательной железы, — искали микроРНК, которые могут быть прогностическими маркерами. В протоколе NEB для библиотек микроРНК написано, что тотальной РНК нужно брать от 100 нанограммов до 1 микрограмма. А у нас на входе было 10 нанограммов на микролитр, то есть в десять раз меньше. Мы использовали набор NEB и на этапе амплификации, когда происходит обогащение библиотек, ставили больше циклов. По умолчанию рекомендовано 12-15, мы ставили 18.

И за счет этого удается получить достаточное количество?

В том числе и за счет этого удается получить достаточное количество микроРНК для секвенирования. Увеличение циклов амплификации — довольно неприятное решение, оно снижает разнообразие библиотеки. Что-то амплифицируется лучше, а что-то — хуже. Это нежелательно, но когда такие сложные образцы, выхода нет. В итоге по результатам секвенирования получилось, что на фракцию микроРНК приходится 80% последовательностей — это много, представленность микроРНК достаточная. Для сравнения, если, например, делать библиотеку из опухолевых образцов, где концентрация входящего материала хорошая, то на фракцию микроРНК в подготовленной библиотеке с использованием набора NEB приходится 88%. Это близкие значения, 80% из плазмы — очень хороший показатель.

Анастасия, спасибо за подробный рассказ!

Как выбрать ваш NEBNext

PCR.NEWS продолжает следить за новыми решениями, позволяющими вывести молекулярно-биологические исследования и лабораторную диагностику в РФ на новый уровень. Мы уделим особое внимание пробоподготовке, а именно оптимальным реагентам и передовому оборудованию для лабораторий с большими потоками, стремящимся к автоматизации и подбирающим готовые решения для производства.

Быстрая и эффективная пробоподготовка для NGS необходима для наращивания объемов секвенирования в Российской Федерации. Выбор редакции пал на автоматическую дозирующую станцию CyBio FeliX (Analytik Jena), которая автоматизирует практически все: от ПЦР, выделения нуклеиновых кислот, NGS, генотипирования и генного редактирования до клеточной биологии и пробоподготовки для МАЛДИ, ИФА, технологий «lab-on-a-chip». Для CyBio FeliX не имеет значения, какой именно метод NGS применяют в вашей лаборатории: это может быть как Illumina, так и IonTorrent.

Зарубежные ученые уже оценили преимущества решений FeliX. «CyBio FeliX составляет основу автоматизации нашего рабочего процесса NGS, весь путь от образца до количественной оценки библиотеки методом ПЦР-РВ запускается одним нажатием кнопки. CyBio FeliX делает это возможным благодаря своей надежности, контролю точности и простоте интеграции», — подчеркивает Стаффан Пиледаль, специалист по программному обеспечению компании LabGenius Ltd, которая разрабатывает белковые терапевтические препараты нового поколения.

Партнерский материал