London Calling 2025: нанопоровое секвенирование в молекулярной диагностике и не только

Дэвид Димер, профессор Калифорнийского университета в Калифорнии и один из создателей нанопорового секвенирования, посвятил свой доклад возможностям этой технологии в исследованиях, связанных с зарождением жизни.

Выступление он начал с отрывка из письма Чарльза Дарвина, которое тот написал Джозефу Хукеру в 1871 г.: «…Но что если — и это большое если — предположить, что в одном из небольших теплых водоемов из всех содержащихся в нем производных аммиака и солей фосфорной кислоты под влиянием света, тепла, электричества и так далее возникло белковое соединение, готовое к дальнейшим более сложным превращениям…». Дарвин оказался удивительно близок к существующей сейчас концепции абиотического происхождения жизни, даже если в пресных прудах Британии, которые он мог представлять, жизнь не могла зародиться попросту из-за их термодинамических свойств. В качестве альтернативного места Димер предложил испаряющуюся лужу наподобие тех, какие он встречал в путешествиях на Камчатке: когда вода из таких лужиц испаряется, повышается концентрация растворенных в ней веществ, которые образуют пленку на минеральных поверхностях.

На Земле 4 миллиарда лет назад — до появления на ней жизни — воздух был очень жарким, в атмосфере из азота и углекислого газа еще не было кислорода, но зато господствовали соленые океаны. Эти условия, по мнению Димера, схожи с условиями, которые некогда были на Марсе, где также могли существовать небольшие водоемы; так что, возможно, и Марс когда-то был пригоден для зарождения жизни.

На Земле и сейчас можно найти местности, которые напоминают пребиотическую Землю в момент зарождения жизни. Это, например, горячие источники на Гавайях, в Исландии, на Камчатке и в Новой Зеландии. Особенно подходящей для исследований, зарождения жизни Димер считает именно Камчатку, где на большой высоте можно встретить горячие источники, которые оказались стерильными после недавней вулканической активности.

Профессор немного рассказал о собственном путешествии в Петропавловск и на вулкан Мутновский. В этой экспедиции, чтобы проверить, действительно ли в таких местностях могла зародиться жизнь, Димер с коллегами получили образцы из фумарол — трещин в поверхности земли, из которых выходят вулканические пары. Однако в образцах не обнаружилось никаких органических веществ. Ученые сделали вывод о том, что температура в фумаролах оказалось слишком высокой, чтобы в них могла появиться жизнь.

В другой экспедиции ученые использовали иной подход. У подножия вулкана они нашли небольшой горячий источник, куда сами внесли «первичный бульон», состоявший из аминокислот, азотистых оснований и веществ-предшественников липидов. Среда в получившемся «бульоне» была кислой из-за диоксида серы, выделяемого с вулканическими газами. В результате в лужице появилась белая пена — агрегаты жирных кислот, нечто похожее на мембраны. Так как маленький водоем постоянно испарялся, пена собиралась по краям, а остальные вещества оказывались как бы захваченными в пленке.

Модель горячего источника можно сделать и самостоятельно. Эта модель состоит из пластикового контейнера, заполненного углекислым газом, и алюминиевого диска с 24 лунками, в которые можно помещать смеси реактивов. Диск может нагреваться до 80℃ и вращаться раз в два часа, чтобы реактивы в лунках высыхали в присутствии углекислого газа. Конденсация приводит к образованию капель воды, которые могут затекать в лунки. Таким образом, система моделирует процессы, которые происходят в реальных горячих источниках.

Чтобы проверить, может ли в таких условиях произойти полимеризация азотистых оснований в нуклеиновые кислоты, в эту установку исследователи поместили кислый раствор мононуклеотидов в воде. Получившуюся смесь анализировали с помощью масс-спектрометрии и нанопорового секвенирования. Данные масс-спектрометрии показали, что в смеси появились олигомеры нуклеотидов длиной вплоть до 43 оснований.

Нанопоровое секвенирование подтвердило образование олигомерных фрагментов нуклеиновых кислот. Если в смеси присутствовал только ТМФ, то формировалась цепочка, состоящая только из тимидина. Добавление в смесь других нуклеотидов позволяло получать случайные последовательности ДНК.

Так ученые доказали, что в горячих источниках, где постоянно происходит испарение жидкости и концентрирование растворенных в ней веществ, могут самопроизвольно образовываться полимеры, на которых основана жизнь. На Марсе, как отметил Димер, тоже могла быть вода, и в седиментах все еще можно найти кристаллы льда. Из-за этого профессор хочет проанализировать образцы с Марса с помощью нанопорового секвенирования: может, и в этих остатках воды остались фрагменты нуклеиновых кислот?

В абиотических условиях вполне могли формироваться протоклетки — мембранные компартменты, содержащие различные полимеры. Считается, что клетки появились в результате селекции и эволюции протоклеток. Именно этим вопросом Димер и собирается заниматься в дальнейшем — проверкой гипотезы о том, что жизнь появилась в результате селекции систем, содержащих инкапсулированные в мембраны полимеры, способные к метаболизму, росту и саморепликации.

Доклад Кимберли Биллингсли, возглавляющей группу прикладной нейрогеномики в Центре изучения болезни Альцгеймера и связанных деменций NIH (США), был посвящен применению секвенирования с длинными прочтениями для геномного анализа нейродегенеративных заболеваний.

Лишь небольшая часть случаев нейродегенераций представляет собой моногенные болезни. В основном они связаны с редкими вариантами в регуляторных последовательностях, изменениями в тандемных повторах, структурными вариантами, аллель-специфичных паттернах метилирования и с прочими механизмами. Технологии секвенирования с длинными прочтениями позволяет регистрировать сложные комбинации этих вариантов, в том числе с учетом эпигенетических механизмов.

В рамках исследования группа планирует секвенировать с помощью PromethION почти три тысячи образцов из разных когорт, включающих как здоровых добровольцев, так и пациентов с болезнями Альцгеймера или Паркинсона и с другими видами деменции. В результате этой работы будет сгенерировано больше 400 ТБ данных. С помощью секвенирования длинных прочтений исследователи также намерены проанализировать аллель-специфические паттерны метилирования ДНК.

Особый интерес для ученых представляет локус APOE, который связан с риском развития болезни Альцгеймера с поздним началом. Разные изоформы APOE по-разному влияют на риск: форма ε4 повышает его, а ε2 — снижает. Также в экзоне 4 этого локуса находится CpG-островок, в котором было найдено множество однонуклеотидных вариаций (SNV), связанных с риском развития болезни Альцгеймера в разных популяциях.

В ходе исследования ученые проанализировали данные нанопорового секвенирования для двух когорт, чтобы выявить CpG-островки в локусе APOE, метилирование которых изменяется в зависимости от изоформы. Для этих целей нанопоровое секвенирование оказалось гораздо чувствительнее методов определения метилирования на основе матриц: с помощью PromethION удалось детектировать в 24 раза больше CpG-островков в этом локусе, чем с помощью матрицы Illumina Infinium 450.

При анализе данных методом линейной регрессии с учетом изоформы APOE, возраста и пола пациентов и других данных ученые нашли те CpG-островки, метилирование которых изменяется при болезни Альцгеймера. Из них 23 сайта метилирования были описаны впервые.

На следующем этапе ученые расширили масштабы работы, чтобы тот же пайплайн применить и к другим важным в контексте нейродегенеративных заболеваний локусам. Для анализа данных аллель-специфичного метилирования применили инструмент ASM-LR. Этот метод позволил повысить чувствительность детекции сайтов метилирования.

На основе полученных данных исследователи разработали прогностические модели, способные по паттернам метилирования предсказывать возраст пациентов и риск развития нейродегенеративных заболеваний. Для этого использовали инструмент машинного обучения GenoML.

Уже существующие эпигенетические часы оказались точными только при анализе данных, полученных от европейцев. Однако эти модели были не применимы к людям другого происхождения. Использование выборки данных пациентов различных этнических групп повысило точность и универсальность эпигенетических часов.

В перспективе исследователи намерены интегрировать в свою работу другие мультиомиксные методы, чтобы анализировать более обширные данные от пациентов с нейродегенеративными заболеваниями.

Часть работы исследователей была посвящена разработке метода секвенирования длинных прочтений РНК, который позволит создать транскриптомный ресурс, посвященный нейродегенерациям. Ученые оптимизировали протокол синтеза кДНК для нанопорового секвенирования при работе с посмертными образцами ткани головного мозга. Это в сочетании с автоматизацией подготовки библиотек позволило улучшить производительность процесса: с обработки 8 образцов за 10 часов до 24 образцов за то же время. Также был разработан пайплайн для анализа данных. Сейчас ученые занимаются разработкой инструмента для анализа данных, который был бы доступен для всех, и анализом 200 контрольных образцов от здоровых людей.

Джонатон Хилл из компании Wasatch BioLabs (США) рассказал об эпигеномном анализе внеклеточной ДНК, происходящей из нейронов с помощью нанопорового секвенирования. Цель такого анализа — улучшение диагностики нейродегенеративных заболеваний.

Чтобы новые эпигенетические биомаркеры стали использоваться в клинике, ученым сперва требуется набрать достаточное количество данных метиломного секвенирования. Затем им нужно создать модель, которая была бы способна определять тип клетки — источника внеклеточной ДНК. После этого исследователям необходимо разработать конкретные тесты, валидировать, сертифицировать и масштабировать их.

В данной работе исследователям была наиболее интересна внеклеточная ДНК, циркулирующая в крови и берущая начало в кортикальных и дофаминергических нейронах — именно они наиболее уязвимы при болезнях Альцгеймера и Паркинсона, соответственно. Для анализа полученных данных секвенирования метилированной ДНК ученые разработали специальный инструмент MethylSeqR. Он позволяет создавать базы данных и анализировать паттерны дифференциального метилирования. Также ученые создали метод сжатия полученных данных о метиломе: 50 ГБ данных секвенирования можно ужать в 5 ГБ файла со специальным расширением CH3.

Используя нанопоровое секвенирование для анализа метилома, исследователи выявили значительное количество CpG-островков, метилирование которых различается в нейронах и циркулирующей в крови ДНК. Их число составило почти 5 миллионов для кортикальных нейронов и 2 миллиона для дофаминергических.

Эти CpG-островки можно объединить в конкретные участки в геноме — это позволяет определить, является ли источником внеклеточной ДНК нужный тип нейронов. С такой технологией уже можно анализировать образцы крови пациентов. Однако в этих образцах не так много крови и, соответственно, не так много внеклеточной ДНК. В связи с этим ученым приходится обходиться ультранизким покрытием при секвенировании: ниже 0,25х.

Исследователи сравнили свой подход к диагностике болезни Альцгеймера с уже используемыми биомаркерами — ими служат pTau217 и соотношение pTau217 к патогенной форме β-амилоида (pTau217/Aβ1-42). Для этого анализировали группу здоровых людей, пациентов с болезнью Альцгеймера и пациентов с умеренными когнитивными нарушениями. Анализ внеклеточной ДНК нейронального происхождения продемонстрировал более высокую прогностическую значимость: показатель PPV (положительная прогностическая ценность) составил 89%, показатель NPV (отрицательная прогностическая ценность) — 100%.

Аналогичным образом создатели теста сравнили его с методом RT-QuIC, который позволяет детектировать альфа-синуклеин в крови и используется для диагностики болезни Паркинсона. Для этого анализировали образцы от здоровых людей и пациентов с болезнью Паркинсона. В этом случае для теста, анализирующего внеклеточную ДНК, показатели PPV и NPV составили 100%, превосходя RT-QuIC.

В перспективе исследователи намерены улучшить воспроизводимость своих результатов и точность модели. Также они хотят валидировать модель на данных лонгитюдных исследований, чтобы она могла использоваться для ранней диагностики болезней Паркинсона и Альцгеймера. Если же в модель включить внеклеточную ДНК, происходящую из других типов нейронов, то можно охватить еще больше нейродегенеративных заболеваний. На основе всего этого исследователи хотят создать панель для секвенирования отобранных регионов, применимую в клинике. Возможно, предложенный подход станет актуальным для диагностики многих других заболеваний.

Кроме того, в ближайшие месяцы Wasatch BioLabs собирается представить новый метод таргетного секвенирования метилированной ДНК, не требующий ПЦР и обладающий высокой чувствительностью.

Джудит Брейер из Института детского здоровья при Университетском колледже Лондона (Великобритания) посвятила свой доклад использованию метагеномики для рутинной диагностики инфекционных заболеваний.

В прошлом году NHS England запустила проект на базе нескольких клинических центров и больниц, посвященный разработке метода быстрой диагностики респираторных заболеваний у пациентов отделения интенсивной терапии с помощью метагеномики. В отличие от привычных методов, этот подход, основанный на нанопоровом секвенировании, должен был предоставлять результаты в тот же день и позволять выявлять в клинических образцах бактерии, грибки и вирусы.

В фрагменте работы, который выполняла команда Брейер, для получения метагеномных данных использовались образцы из верхних и нижних дыхательных путей. Образцы получали от педиатрических пациентов, из кардиологического отделения интенсивной терапии, а также от пациентов на ЭКМО (экстракорпоральная мембранная оксигенация). В результатах ученые сообщали о присутствии в метагеноме любого патогенного организма, даже если он присутствовал в небольших количествах. Анализировали образцы с помощью метагеномного секвенирования, причем все результаты валидировались с использованием ПЦР или культур. За три месяца таким образом было обработано 177 образцов.

Анализ с использованием метагеномики обладал высокой специфичностью — она составляла составляла 99­–100%. Чувствительность метода была выше 50% (вплоть до 83%) даже в случае, если результат требовался в день получения образцов. Если результаты получали на следующий день, чувствительность получалось повысить до 85–100%.

Результаты анализа во многом направляли дальнейший процесс лечения пациентов. В 40% случаев врачи назначали соответствующее антимикробное лечение: либо начинали его, либо меняли препараты на более подходящие. Опрос среди медсестер и врачей также показал, что подавляющее большинство опрошенных сочли анализ метагеномных данных полезным для их работы.

Другая часть работы группы Брейер связана с анализом не полимикробных образцов, а стерильных участков организма, где в норме не содержится микробов. Цель работы в этом случае — это поиск патогенов в стерильных зонах, недоступных для обычных методов, т.е. значительное внимание отводится чувствительности метода. Исследователи хотят разработать методы, позволяющие подтвердить отсутствие патогенов, на основе чего врачи смогут безопасно назначать имунносупрессанты, и отслеживать распространение в организме опасных патогенов.

В этом проекте ученые получают образцы тканей и жидкостей из стерильных зон —мозга, печени, легких, глаза, а также спинномозговой, перикардиальной, плевральной и амниотической жидкости. Анализ проводится на платформе Illumina. С 2014 года исследователи получили около 500 образцов от детей и взрослых, причем сейчас им удается собрать 200–300 образцов в год. Предел детекции РНК у этого метода, основанного на метагеномике, составляет 10–100 копий/мл; в случае ДНК значения разнятся для жидкостей (10–100 копий/мл) и тканей (100–1000 копий/мл).

В 25% образцов (и, что важно, в трети всех образцов от пациентов с нарушенным иммунитетом) ученые смогли найти патогены, которые не получалось детектировать рутинными методами. В 75% случаев на основе результатов врачам приходилось менять лечение: либо назначать новое, либо отменять уже назначенное. Брейер также отметила, что метод на основе метагеномики сохраняет образцы ДНК/РНК самого человека, поэтому их можно дополнительно анализировать на предмет других биомаркеров.

С помощью подхода, основанного на метагеномике, исследователям удалось выявить в стерильных зонах организма 9 новых возбудителей энцефалита. Также в практике встретилось 11 случаев, когда патоген обнаруживался только в ткани мозга, но не в других образцах. Это указывает на то, что при энцефалопатии может быть актуальной диагностика с применением именно биопсии мозга, а не по другим биоматериалам.

Новый виток работы по этому направлению был связан с использованием нанопорового секвенирования вместо платформы Illumina. Для сравнения методов исследователи сделали искусственные клинические образцы, представлявшие собой смесь человеческой ДНК и РНК с вирусным образцома в предопределенных концентрациях. Платформа Illumina не была способна детектировать некоторые ДНК-вирусы при низких концентрациях их генетического материала, а нанопоровое секвенирование имело низкую чувствительность и не обнаруживало некоторые ДНК- и РНК-вирусы. Лучшие результаты показала таргетированная панель Illumina Twist Comprehensive Viral Panel. Этот метод также позволял получить данные на 1,5 дня быстрее ранее используемого метода на основе платформы Illumina, который предоставлял результаты только на пятые сутки.

Тогда ученые задались вопросом, насколько эффективным может быть таргетное нанопоровое секвенирование. Однако существующие сейчас методы включают в себя этап конверсии, который занимает 2-3 часа, является дорогостоящим и слишком трудоемким для рутинной диагностики. Чтобы ускорить процесс, исследователи разработали другой метод лигирования с праймерами для нанопорового секвенирования — ПЦР с 4 праймерами (four-primer post-capture PCR).

Таргетирование позволило значительно повысить чувствительность нанопорового секвенирования. Такой метод также оказался самым быстрым из всех протестированных: результаты были доступны чуть позднее, чем через двое суток.

Таргетное нанопоровое секвенирование получилось ускорить еще больше с сохранением чувствительности. Для этого исследователи заменили метод экстракции ДНК на более быстрый и сократили время гибридизации. Благодаря такой модификации предварительные результаты можно получить уже к вечеру дня, когда запускали анализ, а окончательные — к полудню следующего дня.