Рождение «лютоволка»: фэнтези, НФ или технология

Компания Colossal Biosciences объявила о «возрождении» ужасного волка (Aenocyon dirus). В геномы клеток, полученных из крови волков, было внесено 20 изменений в 14 генах, на свет пока появились три особи: два самца, Ромул и Рем, и самка Кхалиси. С момента своего рождения большие белые волки жили на обширном участке в США, точное местоположение которого держится в секрете, однако там побывали корреспонденты Time. Компания выложила видеоролики с волками и разместила информацию у себя на сайте.

«Когда-то было сказано: “Любая достаточно продвинутая технология неотличима от магии”. Сегодня наша команда может раскрыть часть магии, над которой они работают», — сказал генеральный директор и сооснователь Colossal Бен Ламм. Раскрыта действительно лишь небольшая часть «магии»: научной публикации об этой работе нет.

(Дополнение: 11 апреля на bioRxiv был опубликован препринт статьи «О происхождении и эволюции ужасного волка», в которой описано секвенирование древних геномов, но не редактирование геномов современных волков.)

Палеонтология и палеогенетика

Ужасные волки (Aenocyon dirus), которых с легкой руки Джорджа Мартина все чаще называют лютоволками (в «Игре престолов» этих животных зовут direwolfs, а реальный вымерший вид — dire wolf), были широко распространены в Северной Америке в позднем плейстоцене — начале голоцена. Ужасный волк был несколько крупнее серого волка (вес, по оценкам, до 70 кг, длина до 1,8 м, высота в холке почти метр), с более короткими и крепкими ногами и более массивным черепом. Они охотились на крупных травоядных, а вымерли, как и многие другие представители палеофауны, в четвертичном периоде, 13 000–10 000 лет назад — вероятно, из-за меньшей пластичности охотничьих привычек, чем у серого волка или койота. Многочисленные фрагменты костей ужасного волка — более 4000 особей, в сто раз больше, чем костных остатков серого волка в той же локации, — были найдены в битумных озерах Ранчо Ла Бреа (Калифорния). В начале ХХ века он был описан как Aenocyon dirus, потом его включили в род Canis, к которому принадлежат современные собаки и волки, однако после ДНК-анализа ему вернули первоначальное название, выделив в отдельный род.

Смилодон прогоняет ужасных волков от туши колумбийского мамонта в битумном озере Ла Бреа. Роберт Брюс Хорсфолл, 1913. Credit:  Wikimedia

Статью об исследовании ДНК ужасного волка опубликовал журнал Nature в 2021 году. Большая группа палеонтологов и палеогенетиков пыталась получить ДНК из 46 образцов, но секвенировать удалось только пять. Многочисленные находки из Ла Бреа для секвенирования подходят плохо, поскольку компоненты битума проникают в костную ткань. Тем не менее авторам удалось секвенировать не только митохондриальный, но и ядерный геном с покрытием от 0,01× до 0,23×.

Именно по результатам этой работы Aenocyon dirus стал отдельным родом, причем исследователи не нашли никаких признаков генных потоков между ужасными волками и серыми волками или койотами. Согласно этим данным, линия ужасного волка отделилась от других волков, собак и шакалов около 5,7 млн лет назад и длительное время эволюционировала в Северной Америке, в отличие от серых и красных волков и койотов, которые пришли туда из Евразии существенно позднее.

Как сообщается на сайте Colossal, компания смогла получить доступ к двум наиболее перспективным образцам с помощью директора по науке Colossal Бет Шапиро, которая участвовала в работе 2021 года, и исследовать их повторно. Это были два музейных образца: зуб возрастом 13 000 лет из Шеридан-Пит, штат Огайо, и косточка внутреннего уха возрастом 72 000 лет из Американ-Фолс, штат Айдахо. Компания заявляет, что команда из шести человек благодаря собственному процессу выделения и анализа ДНК получила «более чем в семьдесят раз больше данных о геноме ужасного волка, чем было достигнуто ранее» (о каком именно количественном или качественном показателе секвенирования идет речь, не уточняется). Упоминаются специально разработанные компанией программное обеспечение и алгоритмы для анализа и сравнения древней ДНК, которые «позволили определить ключевые гены и регуляторные варианты, необходимые для воскрешения» ужасного волка.

Геномные данные Colossal, говорится в пресс-релизе, указывают на то, что эта линия впервые появилась в позднем плиоцене, 3,5–2,5 млн лет назад, в результате смешения двух еще более древних (и ныне вымерших) линий псовых.

Дополнение: Подробнее об этой части работы теперь можно прочитать в статье сотрудников Colossal с коллабораторами, размещенной на bioRxiv. В ней сообщается, что палеогеномы из двух образцов, зуба возрастом около 13 000 лет и косточки внутреннего уха возрастом 72 000 лет, получены с покрытием 3,4× и 12,8× соответственно. Авторы построили консенсусные филогенетические деревья для Aenocyon dirus и 10 других видов псовых. По их данным, примерно две трети предков ужасных волков происходят от линии, сестринской по отношению к кладе, включающей серого волка, койота и красного волка, а оставшаяся треть — от линии, близкой к основанию разнообразия таксона Canini (эта линия отделилась от общих предков раньше, чем африканская дикая собака; от нее произошел также южноамериканский гривистый волк). Есть свидетельства генного потока от ужасного волка к общему предку серого волка и койота. Также авторы идентифицировали 80 генов ужасных волков, которые эволюционировали под действием диверсифицирующего отбора.

Трогательно, что среди соавторов работы присутствует Джордж Р.Р. Мартин в качестве «инвестора и консультанта по культуре Colossal Biosciences».

Мишени редактирования

Геном ужасного волка сравнили с тысячами современных геномов волков, и таким образом были идентифицированы как минимум 92 гена, способных влиять на размер, мышечную массу, черепно-лицевую морфологию, цвет и длину меха, сообщается на сайте Colossal. В частности, увеличение размера обеспечила модификация гена LCORL (Ligand dependent nuclear receptor corepressor like). Он кодирует транскрипционный фактор, который контролирует экспрессию сотен других генов, связанных с размером тела и ростом. Его варианты, связанный с размером тела, найдены у многих млекопитающих, включая людей, свиней, лошадей, крупный рогатый скот и собак. Авторы текста на сайте отмечают, что отличие в гене LCORL ужасного волка от того же гена у серого волка и небольших собак сходно с тем вариантом, который встречается у датского дога. (У крупных собак утрачен один из функциональных доменов LCORL — PRC2, у ужасного волка, согласно результатам 3D-моделирования, изменена структура этого домена.)

Этот ген стал одним из 14 генов волка, подвергнутых CRISPR-редактированию; в генах было сделано в общей сложности 20 модификаций, из них 15 соответствовали вариантам, найденным в древней ДНК. (Всего у волка и других псовых около 19 000 генов.) У шерстистой «мамонтомыши», о которой недавно писали СМИ, сделано 8 точных исправлений в геноме. Еще больше мишеней редактирования было в геномах свиней, которые «очищали» от ретровирусов, с тем, чтобы получить безопасные донорские органы (среди руководителей этой работы был Джордж Черч, сооснователь Colossal), но эти мишени не были уникальными.

Несоответствие «древним образцам» по крайней мере частично связано с пигментацией шерсти. У ужасного волка были найдены три гена, полиморфизмы в которых отвечают за белый окрас у современных животных и альбинизм у людей. Как пишет CRISPR Medicine News, это гены OCA2 и SLC45A2, активные в меланоцитах и вовлеченные в продукцию пигмента, и MITF, ключевой регулятор развития самих меланоцитов. Данную находку можно считать молекулярным подтверждением белого цвета шерсти плейстоценовых «лютоволков». (Возможно, эти мутации и ускорили их вымирание, когда закончился ледниковый период?) Но модификации MITF могут привести к глухоте или слепоте. Поэтому команда Colossal нацелилась на другие мишени: гены MC1R и MFSD12.

Активация рецептор меланокортина 1 MC1R в мембране меланоцита переключает его с продукции желто-рыжего феомеланина на коричнево-черный эумеланин, инактивирующие мутации в этом гене часто встречаются у рыжеволосых людей. Ген MFSD12 кодирует мембранный транспортер, доставляющий цистеин в меланосомы меланоцитов, где из-него синтезируются пигменты. Снижение его экспрессии приводит к появлению более темных фенотипов. Однако есть работа, в которой описаны собаки белого и кремового окраса с нефункциональным MC1R и миссенс-вариантом в MFSD12. Такие собаки сохраняют пигментацию глаз, носа, губной каймы и подушечек лап. Можно предположить, что именно подобный вариант выбрали сотрудники Colossal. Волки получились светлыми, каким, очевидно, был и ужасный волк, но генетический механизм другой. Некоторые комментаторы были разочарованы таким решением, но другие посчитали его правильным, так как оно минимизирует риски для животных.

Клонирование

Еще один интересный факт: Colossal разработала процедуру получения из крови эндотелиальных клеток-предшественников (EPC), которые можно использовать вместо фибробластов для клонирования. Эти клетки дифференцируются в клетки эндотелия кровеносных сосудов; но они менее дифференцированы, чем фибробласты, и их проще перепрограммировать. Взятие крови — менее инвазивная процедура, чем биопсия ткани, и она лучше подходит для полевых условий и работы с редкими видами, подчеркивает компания. (Спасение редких и вымирающих видов — один из приоритетов Colossal, помимо возрождения уже вымерших.)

Четырех серых волков — доноров клеток отобрали среди примерно 20 особей из заповедников в США, причем выбирали животных с минимальной примесью от домашних собак. Ядра клеток с геномными модификациями перенесли в лишенные ядер яйцеклетки серой волчицы; из 45 сконструированных яйцеклеток три жизнеспособных эмбриона были имплантированы суррогатным матерям — беспородным собакам крупного размера. Течение беременностей еженедельно контролировали на УЗИ; щенки появились на свет с помощью кесарева сечения, чтобы минимизировать осложнения.

Самцы Ромул и Рем родились 1 октября 2024 года, самка по имени Кхалиси — 30 января 2025 года. Рацион старших волков включает оленину, говядину, конину и субпродукты. Живую добычу им пока не дают, хотя не исключено, что они охотятся на мелких грызунов в вольере. У них белая шерсть, и предполагается, что они вырастут очень крупными. Поведенческие особенности сходны с волчьими: ранний вой (с двухнедельного возраста) и недоверчивость к людям.

СМИ и соцсети активно обсуждают, можно ли считать этих животных настоящими лютоволками Aenocyon dirus. Большинство сходится на том, что конечно же нет, они просто похожи. (Хотя насколько точны наши знания о том, как выглядел ужасный волк, — отдельный вопрос.)

Но специалистов интересует и другой круг вопросов. Прежде всего это подробности экспериментального протокола — как именно были внесены 20 исправлений в геном и какие гены были затронуты, какова была эффективность процедуры, то есть сколько отредактированных клеток и яйцеклеток «ушло в брак», чтобы получить трех волчат. Редактирование по 20 локусам — впечатляющий результат, и технологии, которые помогли его достичь, могут быть применены в самых разных областях «серьезной» науки и медицины. Джорджа Черча СМИ чаще всего упоминают как идеолога эксцентричных проектов вроде клонирования мамонта, однако молекулярным биологам он известен и как разработчик методов высокопроизводительного секвенирования и манипуляций с ДНК.

Colossal заявляет, что находится на пути к суррогатной беременности слонихи в 2026 году, и эта слониха через два года может родить мамонта. «Все это нелегко и недешево — хотя при оценке в 10,2 млрд долларов у Colossal есть ресурсы, чтобы заниматься наукой, не слишком беспокоясь о цене», — пишет Time. Но можно предположить, что представители компании не делали бы таких заявлений, если бы эффективность их технологии не была очень высокой: эксперименты со слонами намного дороже, чем с мышами или собаками.

PCR.NEWS спросил о новой сенсации от Colossal у российских исследователей, которые секвенируют древнюю ДНК или редактируют геномы современных животных.

Артём Недолужко, к.б.н., научный руководитель лаборатории палеогеномики Европейского Университета в Санкт-Петербурге, руководитель генетического направления проекта «Арктическая сирена»: «Будет интересно сравнить их с ископаемыми останками».

Являясь горячим сторонником идеи восстановления вымерших животных, должен отметить несколько нюансов, которые доступны к настоящему времени. Согласно данным палеогеномики, ужасный волк (Aenocyon dirus) и серый волк (Canis lupus) произошли от общего предка почти шесть миллионов лет назад, более того, сравнительный анализ геномов не выявил событий межродовой гибридизации между ними впоследствии, несмотря на перекрывающиеся ареалы в позднем плейстоцене.

В своем пресс-релизе компания Colossal Biosciences представила результаты редактирования генома серого волка, которое включило в себя внесение 20 ДНК-полиморфизмов в 14 его генов, создание отредактированных эмбрионов, а затем и детенышей, которые, повзрослев, по-видимому, приобретут некоторые черты ужасного волка — более крупные размеры, иное строение мышц, зубов и черепа, которые отличали это вымершее животное от его серого собрата.

Безусловно, за шесть миллионов лет, прошедших после дивергенции этих двух видов, ужасный волк и серый волк генетически различались между собой в большей мере, чем мизерные 20 мутаций. Будет интересно оценить фенотипы повзрослевших животных и соотнести их с имеющимися в распоряжении палеонтологов ископаемыми остатками.

Важно отметить, что данное исследование подпитывает интерес к проектам возрождения вымерших животных и просто необходимо для привлечения дополнительного финансирования. Хочется верить, что оно также ускорит развитие отечественного проекта «Арктическая сирена», авторы которого нацелились на возрождение вымершей стеллеровой коровы, истребленной во второй половине XVIII века на Командорских островах».

Эрдэм Дашинимаев, к.б.н., зав. лабораторией биоинженерии НИИ молекулярной и клеточной медицины РУДН, зав. лабораторией клеточного репрограммирования НИИ трансляционной медицины РНИМУ им. Н.И. Пирогова: «Методологически эта работа заслуживает большого внимания»

Пока нет статьи, мы ориентируемся только на новости. На сайте Time говорится, что было 20 мишеней в 14 генах. И это довольно круто: большинство исследовательских работ — это один, два, три или четыре локуса, сделанные за раз. Это методологии уровня, как говорят на жаргоне, rocket science. Эти ребята брали образцы крови, из них вылавливали эндотелиальные клетки. В периферической крови всегда плавают стромальные клетки, которые можно разогнать в культуре, что довольно сложно. Видимо, тоже какой-то ноу-хау у них есть по этому поводу: они много работают с клонированием собачьих, и понимают, как и на каких средах это делать. Дело в том, что эти клетки не иммортализованы, как правило. Возможно, они их и репрограммировали в индуцированные плюрипотентные столовые клетки, но когда клетки не иммортализованы, на них невозможно сделать 20 редактирований генома подряд. После каждой итерации редактирования генома вам нужно отобрать те клетки, где редактирование произошло, а довольно часто это происходит с вероятностью 1% или 10%, то есть нужно на каждом этапе оставить одну клетку из 10 либо один из 100. И, скорее всего, эти ребята знают, как делать множественное редактирование генома за один или, может быть, два-три раунда. При этом им не требуется миллион клеток, то есть выход довольно хороший.

Соответственно, дальше делали перенос ядра из соматической клетки в яйцеклетку, так называемое клонирование. Это уже в принципе не является какой-то супертехнологией. Хотя центров, где могут сделать перенос ядра, чтобы потом родилось животное, не так много. В России, например, ни одного нет, хотя есть парочка мест, где почти такое умеют делать. Но так, чтобы на собаках это было отработано, — думаю, во всем мире есть два-три таких места. И одно их них — компания Colossal.

Насколько я понял, у них 45 сконструированных яйцеклеток вошло в дробление эмбрионов, их, соответственно, подсаживали, вероятно, на стадии морулы или бластоцисты, и прижилось только три. На мышах обычно эффективность больше — из десяти введенных эмбрионов могут родиться пять-шесть, но на собаках, возможно, это нормальная статистика. Собаки менее исследованные объекты.

Я думаю, что как правило, не все яйцеклетки входят в дробление, какие-то не переживают манипуляций с переносом ядра. Во времена, когда клонировали овечку Долли, насколько я помню, из нескольких тысяч эмбрионов родилась одна овца. Но с тех пор прошло много времени, поэтому вполне возможно, что у компании есть ряд уникальных ноу-хау, и, может быть, у них эффективность переноса ядра близка к 100%. Мы этого не знаем, я думаю, нам и не расскажут. Коммерческая компания имеет полное право не публиковать эту методологию и, скорее всего, не будет, потому что это деньги.

Можно что-то предположить о том, как они редактировали 20 мишеней? Неужели доставляли 20 редактирующих конструкций в одно ядро?

Опять же, нет никаких указаний, как они это делают. Вполне возможно, речь идет о довольно простых заменах, в том числе однонуклеотидных, поскольку геномы ужасного волка и серого волка, я так понимаю, весьма близки. Видимо, была проделана большая работа по биоинформатике для понимания, в каких местах и что нужно менять. Они могли применять и не те стандартные методы, которые используют все молекулярные биологи, — CRISPR-Cas9, гидовая РНК, ДНК-донор, — а, например, base editor, редактор оснований, когда CRISPR без разрезания нуклеотидной цепочки просто меняет азотистое основание. Либо prime editing, когда делается не двухцепочечный разрыв, а одноцепочечный и происходит замена небольшой последовательности, буквально трех, пяти, десяти трех нуклеотидов. Обе технологии тяжелее, чем CRISPR-Cas9, для понимания и отработки, но они более эффективны в плане точности. И мне кажется, что была проделана гигантская работа по валидации всех этих редактирующих конструкций, и потом они при помощи каких-то ноу-хау умудрились это сделать за один-два раунда редактирования. Или же была какая-то хитрая игра с клетками.

Безусловно, это не тот самый гигантский волк, потому что всех мутаций там, естественно, больше 20. Это животное, напоминающее гигантского волка. Тем не менее, я думаю, методологически эта работа заслуживает большого внимания.

Источники

Jeffrey Kluger. The Return of the Dire Wolf // Time. Apr 7, 2025

Пресс-релиз Colossal Biosciences

Gregory L. Gedman, et al. On the ancestry and evolution of the extinct dire wolf // bioRxiv. 2025. DOI: 10.1101/2025.04.09.647074