Воскресное чтение. Обзор научной периодики за 1–7 июня (без коронавируса)

Иммунотерапия

1. Один из центральных «винтиков» механизма работы регуляторных T-лимфоцитов — транскрипционный фактор FOXP3. Аутологичные Treg, продуцирующие FOXP3, рассматриваются как важный инструмент терапии различных аутоиммунных патологий. Однако Treg присутствуют в периферической крови в весьма малых количествах и с трудом поддаются выделению. Интернациональная группа исследователей предложила иной подход, чем выделение Treg: конверсию CD4+ T-клеток в Treg можно осуществить путем оверэкспрессии в них белка FOXP3. В работе, опубликованной в Science Translational Medicine, конверсии T-клеток добились, введя сильный промотор и энхансер в область перед началом трансляции белка FOXP3 таким образом, чтобы обойти участок ДНК, ответственный за эпигенетический сайленсинг транскрипции. Гомологичную рекомбинацию осуществляли при помощи нуклеазы TALEN, доставленной AAV-вектором. В результате модифицированные Т-лимфоциты проявляли выраженные свойства Treg, заключающиеся, в частности, в иммуносупрессии, подтвержденной на моделях in vitro и in vivo. Такие клетки, в отличие от «естественных» Tregs, могут быть очищены и размножены с соблюдением клинических протоколов для клеточной терапии. По мнению авторов, разработанный подход сыграет важную роль в развитии клеточной иммуносупрессивной терапии.

2. Коррекция регуляторных Т-клеток становится весьма популярной темой в области разработки терапии всевозможных аутоиммунных заболеваний, в том числе сцепленного с полом синдрома IPEX. Первоначально IPEX связывался только с мутациями в вышеупомянутом FOXP3, однако выяснилось, что имеется целый ряд генов, мутации в которых вызывают IPEX-подобные заболевания. До сих пор было неясно, обратимо ли аутоиммунное поражение организма при генетической коррекции таких мутаций. Международная группа исследователей изучала одну из таких мутаций, вызванную делецией фактора ремоделинга хроматина Brg1. Используя методику временного включения-выключения аллели Brg1 в нокаутных животных, совмещенную с системой оценки количества Treg, содержащих мутантный и ревертантный Brg1, авторы работы показали, что даже небольшой процент регуляторных лимфоцитов, содержащих функциональный Brg1, способен блокировать аутоиммунный синдром. Эти клетки, присутствующие в небольшом количестве, но эффективно блокирующие аутоиммунную реакцию, получили обозначение SuperTreg. Ученые считают, что разработанная методика может быть адаптирована к терапии пациентов с IPEX синдромами. Работа опубликована в Nature Communications.

3. Авторы исследования, также опубликованного в Nature Communications, использовали бактерии для активации иммунной системы с целью обеспечения иммунотерапии опухолей. Известно, что штамм непатогенной кишечной палочки Nissle обладает опухолевым тропизмом, не размножаясь в окружающей здоровой ткани модельных мышей. Присутствие бактерии активирует врожденный иммунитет, воздействуя на толл-подобные рецепторы, и таким образом усиливает атаку иммунной системы на опухоль. Однако, этой активации, как правило, недостаточно для элиминации опухоли, в связи с чем исследуются дополнительные факторы, способные повлиять на опухолеспецифический иммунный ответ. Одним из таких факторов могут быть стимуляторы генов интерферона (STING), в особенности низкомолекулярной природы. В новой работе ученые сконструировали вариант E. coli Nissle — суперпродуцент низкомолекулярного STING, цикло-ди-АМФ. Этот динуклеотид встречается исключительно в бактериях и служит мощным активатором неспецифического иммунного ответа. По мнению авторов, разработанный бактериальный штамм является значительным шагом вперед в создании безопасной и эффективной иммунотерапии на основе индукции иммунного ответа к инфильтрирующим новообразование бактериям-активаторам.

4. Активацию врожденного иммунитета, призванную повысить эффективность иммунотерапии опухолей ингибиторами контрольных точек иммунного ответа, описали авторы исследования, опубликованного в PNAS. Ученые создали мультивалентный конструкт, несущий CpG-олигонуклеотиды — один из наиболее эффективных индукторов врожденного иммунитета. В качестве носителя выступали нанокомплексы, содержащие миристоилированные пептиды, за счет которых обеспечивалось специфическое связывание с клетками опухоли и преодоление клеточной мембраны. Специфическое таргетирование опухоли позволяет вводить нанокомплексы внутривенно, а не непосредственно в опухоль. Введение в состав нанокомплексов CpG-олигонуклеотидов позволило активировать врожденный иммунитет в микроокружении опухоли и ингибировать ее рост. При комбинированном введении экспериментальным животным антител к CTLA-4 и нанокомплексов наблюдался не только синергический противоопухолевый ответ, но и значительное снижение эффективной дозы антител. Последнее может быть весьма существенным фактором устранения побочных эффектов при терапии ингибиторами контрольных точек иммунного ответа. По мнению исследователей, успешное испытание иммуностимулирующих нанокомплексов является большим шагом вперед в разработке новых методов противоопухолевой терапии.

Онкология

5. Развитие опухолей — процесс гораздо более сложный, чем просто злокачественная трансформация и неконтролируемое размножение собственно опухолевых клеток. Поскольку опухоль развивается в организме, неудивительно, что другие типы клеток (например, регуляторные Т-лимфоциты) вовлекаются в процесс онкогенеза. Фибробласты, ассоциированы со многими опухолями, однако их взаимодействие с опухолями и роль в онкогенезе изучены недостаточно. Исследователи, опубликовавшие в Cell Reports результаты анализа метаболизма фибробластов, ассоциированных с опухолью молочной железы, показали, что эти клетки снабжают опухоль «провиантом». В условиях опухолевого микроокружения фибробласты претерпевают метаболический сдвиг и начинают продуцировать молочную и пировиноградную кислоты, являющиеся «топливом» для клеток опухоли. Механизм такого сдвига связан с гипоксией, наблюдаемой в области опухолей, и ассоциированным с гипоксическими изменениями эпигенетическим перепрограммированием транскрипции. Перепрограммированию подвергается работа как гликолитических ферментов, так и гипоксического фактора HIF-1α. Блокировка продукции молочной кислоты в таких фибробластах препятствует росту новообразования. По мнению авторов исследования, эпигенетическое перепрограммирование опухоль-ассоциированных фибробластов под действием гипоксии является весьма важным элементом конверсии опухоль-ассоциированных клеток, который может быть использован в качестве мишени для противораковой терапии.

6. Адаптация опухолевых клеток к условиям стресса, вызванным гипоксией, быстрым ростом и другими изменениями опухолевых клеток по сравнению с нормальной тканью осуществляется многими различными путями. Как выяснили авторы работы, опубликованной в Science, в процессе стрессового ответа, опосредованного mTOR, происходит переключение путей репарации ДНК. При этом работают механизмы, обуславливающие значительное накопление ошибок репарации. Очевидно, что накопление ошибок сопровождается снижением фитнеса клеток, однако в результате селективного давления (например, при применении противоопухолевых препаратов) происходит отбор мутаций, обеспечивающих резистентность, в то время как остальные клетки (в том числе и более эффективно размножающиеся, но чувствительные к лекарству) погибают. На следующем этапе, резистентные клетки стабилизируются за счет накопления «мутаций-противовесов», компенсирующих эффекты потери фитнеса. По мнению авторов, таргетирование нескольких путей, модулирующих фитнес опухолевых клеток, в частности, репарации ДНК, и одновременное давление на опухоль классическими препаратами, может вызвать летальную мутационную нагрузку, повышая шансы на элиминацию опухоли.

Антибиотики

7. Распространение антибиотикорезистентных штаммов провоцирует поиск новых антибактериальных препаратов. Одним из них является природный антибиотик теиксобактин, активный в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Механизм действия теиксобактина до конца не изучен, при этом антибиотик плохо растворим и весьма сложен для синтеза. Для создания эффективных синтетических аналогов антибиотика необходим дополнительный структурно-функциональный анализ, который и проводил коллектив европейских исследователей. Опубликованные в Nature Communications результаты показывают, что синтетический аналог теиксобактина, обладающий улучшенной растворимостью, связывается не только с ранее описанной мишенью — молекулой-предшественником клеточной стенки липидом II, но и с другими компонентами клеточной стенки. Оказалось, что теиксобактин формирует большие кластеры в мембране бактерий, которые, по мнению исследователей, связывают синтезирующиеся компоненты клеточной стенки, убивая таким образом микроорганизм. Скорость формирования кластеров микрометрового размера совпадает с кинетикой гибели микроорганизмов, а исследования флуоресцентно-меченых аналогов теиксобактина показали их колокализацию с участками синтеза клеточной стенки бактерий.

8. Дуализм в действии антибиотика — лучшая гарантия предотвращения развития резистентности. Это верно как для природных, так и для искусственно созданных молекул. Исследователи, доложившие в журнале Cell о создании молекулы двойного действия, обозначенной как SCH-79797, показали, что данное вещество не способствует развитию резистентности. Антибиотик SCH-79797 одновременно нарушает целостность бактериальной мембраны и ингибирует метаболизм фолиевой кислоты. Вещество оказывается более эффективно, чем стандартная комбинированная терапия против персистирующих метициллин-резистентных стафилококков. Оптимизированный вариант SCH-79797, названный авторами Irresistin-16, оказался высокоактивен в отношении мышиной модели инфекции грамотрицательным патогеном Neisseria gonorrhoeae. По мнению авторов, комбинирование нескольких антибактериальных активностей в рамках одной химической матрицы является высокоэффективным методом создания антибиотиков, противостоящих эволюции лекарственной устойчивости.

Противовирусная терапия

9. Терапия комбинированного действия может иметь повышенную эффективность не только при бактериальной, но и при вирусной инфекции. Авторы работы в Cell Host and Microbe изучали воздействие нейтрализующих антител на вирус гепатита B (HBV). Несмотря на то, что эффективная специфическая терапия HBV-инфекции отсутствует, организм больного во многих (но не во всех) случаях вырабатывает иммунный ответ, способный справиться с инфекцией. Анализ 124 вакцинированных и 20 спонтанно излечившихся от гепатита B людей показал, что ряд субъектов продуцирует нейтрализующие антитела широкого спектра к одним и тем же трем неперекрывающимся эпитопам антигена S HBV. Взятые по отдельности, эти антитела защищали гуманизированых мышей от инфекции, однако не полностью, поскольку под давлением антител происходила селекция резистентных вариантов вируса. Если же нейтрализующие антитела брались в комбинации, то защита была полной. Анализ структуры одного из эпитопов, распознаваемых антителами, показал, что эпитоп часто подвержен мутации в вариантах вируса, устойчивых к данному антителу. Вместе с тем, давление двух и более нейтрализующих антител оказывается непосильным для фитнеса вируса, что и обуславливает спонтанное излечение от инфекции.

10. Нестандартные подходы используются и в создании противовирусных препаратов. Авторы исследования, опубликованного в Nature Communications, сконструировали амилоидный пептид, способный связываться с вирусом гриппа и замедлять его репликацию. Конструирование базировалось на знании о структуре амилоидов и идентификации в вирусных белках участков, вовлекающихся в формирование амилоидных структур в присутствии провоцирующих пептидов. Впервые формирование таких структур было обнаружено в естественном амилоиде, Aβ-пептиде, ассоциированном с болезнью Альцгеймера. Амилоидные «зародыши» пептида Aβ оказались способны ингибировать герпесвирусную инфекцию, «выпадая в осадок» с вирусными белками. Используя методы синтетической биологии, авторы новой работы сконструировали пептиды, способные образовывать амилоидные агломераты с белками вирусов гриппа и Зика. Эти пептиды формировали амилоиды только в присутствии соответствующих вирусных белков и не имели перекрестной специфичности. Исследователи считают, что формирование амилоидов происходит котрансляционно, поскольку участки белка, вовлеченные в образование этих структур, находятся глубоко в полипептидной молекуле и вряд ли могут взаимодействовать с внешним пептидом в свернутом белке. Для обоих типов амилоидных пептидов было показано ингибирование вируса, причем в случае вируса гриппа оно было подтверждено на модели инфекции в мышах. Искусственно созданные амилоидные пептиды быстро выводились из организма и не формировали нерастворимых структур с другими белками. По мнению авторов, созданные пептиды могут служить как инструментом для исследования патогенеза вирусных заболеваний, так и для разработки новых противовирусных препаратов.

Инфекции

11. Clostridium perfringens, микроорганизм, вызывающий как газовую гангрену, так и фатальный некротизирующий геморрагический энтерит у человека и животных, несет несколько токсинов, значительно отличающихся по механизму действия. Один из них, бета-токсин (CPB), является критическим фактором вирулентности для клостридий — возбудителей энтерита. Механизм действия CPB, тем не менее, оставался неизученным. Авторы исследования, опубликованного в Cell Host and Microbe, продемонстрировали, что CPB связывается с белковой молекулой, известной как CD31 или PECAM-1, экспрессирующейся на поверхности эндотелиальных клеток сосудистой сети тонкого кишечника. Продукция CD31 — обязательный фактор токсичности: клетки, в природе не содержащие данный рецептор, становились чувствительными к CPB, если в них вводили экспрессионный конструкт, кодирующий СD31. Структурно-функциональный анализ показал, что шестой домен иммуноглобулин-подобного белка CD31 необходим для связывания CPB и повреждения им клеточной мембраны. По мнению авторов, результаты исследования свидетельствуют о дешифровке механизма токсичности CPB.

12. Респираторные инфекции на своем пути встречают обонятельные нейроны, аксоны которых достигают непосредственно головного мозга. Однако вирусы крайне редко поражают мозговую ткань, что свидетельствует о наличии специфического механизма высокоэффективной защиты головного мозга от инфекции. Что это за механизм, разбирались авторы исследования, опубликованного в Science Immunology. Оказалось, что обонятельные нейроны инфицируются вирусом везикулярного стоматита (VSV) у модельных мышей, но в дальнейшем вирусная инфекция элиминируется без уничтожения этих клеток. В то же время, избирательная делеция MHC-I из обонятельных нейронов никак не влияла на элиминацию VSV. Дальнейший анализ показал, что за эффективную презентацию MHC-I-связанных пептидов VSV ответственны клетки микроглии, окружающие нейроны, и что пептиды передаются в эти клетки из цитоплазмы нейронов. При этом сами клетки микроглии вирусом не инфицируются, но их удаление приводит к повышению чувствительности к нейротропной инфекции VSV и блокировке кальциевых сигналов T-лимфоцитам. В модели, разработанной на основе данных исследования, авторы рассматривают клетки микроглии в качестве эффективных антигенпрезентирующих клеток, которые активируют Т-лимфоциты при инфекции обонятельных нейронов. Активированные Т-клетки затем элиминируют вирус из нейронов, не допуская, однако, их лизиса. И хотя детали этого сложного механизма еще предстоит выявить, ясно, что кросспрезентация вирусных антигенов клетками микроглии играет ключевую роль в защите мозга от инфекции VSV.

Диагностика

13. Предсказание эффективности иммунотерапии в отношении пациентов с острым миелоидным лейкозом (AML) крайне затруднено. Анализ паттернов экспрессии генов в клинических образцах, полученных из костномозговых биопсий 442 пациентов с AML, проведенный авторами публикации в Science Translational Medicine, показал, что определенные сигнатуры экспрессии белков, относящихся к интерферон-гамма-зависимому ответу, могут служить для предсказания эффективности терапии пациентов иммунотерапевтической молекулой flotetuzumab. По мнению авторов исследования, комбинированное профилирование протеома и транскриптома микроокружения опухоли, в частности, выявление продукции интерферон-гамма-зависимых молекул, может служить для предсказания эффективности терапии флотетузумабом, а также для разработки персонализированного подхода к терапии AML.

14. Результаты клинических испытаний EAGLE, проведенных компанией AstraZeneca в рамках изучения возможности терапии рака головы и шеи новым ингибитором PD-1, к сожалению, нельзя назвать обнадеживающими ввиду высокой начальной смертности пациентов. Вместе с тем, эти испытания дали значительную информацию для разработки предсказательной диагностики в терапии этого сложного вида опухолей. В процессе испытаний выяснилось, что пациенты с повышенной скоростью мутагенеза опухоли показывали лучшую выживаемость при терапии экспериментальным ингибитором PD-1, в то время как пациенты с низким уровнем мутационной нагрузки имели значительно более высокие показатели выживания при стандартной химиотерапии. Эти результаты получены при помощи анализа биопсийного материала. Согласно комментариям ведущих испытания медиков, получение и анализ ДНК биоптатов является сложной задачей, поэтому для рутинной диагностики этот метод малопригоден. Если обнаруженный эффект подтвердится при анализе циркулирующей опухолевой ДНК, медицина получит новый диагностический инструмент для выбора наиболее эффективной терапии при опухоли головы и шеи.

Технологии

15. Сразу три группы исследователей (команды под руководством ученых из Китая, США и Японии) отрапортовали в Nature Biotechnology о создании систем для двойной замены С на Т и А на G. Все конструкты базируются на инактивированных нуклеазах-редакторах, но отличаются архитектурой цитозин- и аденозин-дезаминаз. Согласно опубликованным данным, все конструкты уверенно вносят мутации в узком «окне» ДНК шириной в несколько нуклеотидов и обладают незначительным уровнем нецелевой активности. По мнению авторов работ, сконструированные ферменты значительно расширят потенциал мутационного анализа и конструирования мутантных молекул ДНК.

16. Для чего еще могут пригодиться нуклеазы, точечно корректирующие единственное основание? Конечно же, для «лечения» точечных мутаций, вызывающих наследственные заболевания, убеждены авторы работы, опубликованной в Cell Reports. Но для этого они должны обладать высокой точностью редактирования и не мутировать ДНК вне мишени. Нуклеазы, основанные на никазной активности Cas9, недостаточно точны, а главное — вызывают двухцепочечные разрывы в ДНК и нежелательную активацию системы репарации, утверждают авторы, и предлагают систему, созданную на основе Cas12 и цитозиндезаминазы APOBEC3A. Созданную систему авторы назвали BEACON и показали, что она обладает высокой точностью редактирования и низким уровнем активации репарационной системы, включая белки H2AX, ATM, ATR, и p53. Более того, авторам удалось с помощью BEACON внести точечную мутацию в мышиные эмбрионы и подтвердить ее наличие в поколении F0.