ВОЗ опубликовала рекомендации по контролю устойчивых к лекарствам патогенов с помощью полногеномного секвенирования

Устойчивость к противомикробным препаратам (УПП)— серьезная угроза общественному здоровью и устойчивому развитию, говорится в рабочем документе ВОЗ, опубликованном 22 сентября 2020 года. Отслеживать появление новых и распространение существующих устойчивых патогенов особенно важно, поскольку в настоящее время не хватает препаратов, которые можно было бы использовать против штаммов с множественной, широкой или полной устойчивостью к существующим лекарствам.

Глобальная система надзора за устойчивостью к противомикробным препаратам и их применением ВОЗ (Global Antimicrobial Resistance and Use Surveillance System, GLASS) осуществляет мониторинг нескольких патогенов приоритетной важности с использованием данных, которые получают фенотипическими методами тестирования — традиционными микробиологическими методами, такими как метод серийных разведений или диско-диффузионный метод. Однако в течение последнего десятилетия большое распространение получили молекулярные методы. Современное состояние технологий позволяет говорить о широком использовании полногеномного секвенирования патогенов.

Стратегия

Полногеномное секвенирование (ПГС) предоставляет полную или почти полную последовательность ДНК микроорганизма — это огромный объем полезной информации. Полученную последовательность можно сравнить с базами данных, в том числе с теми, где представлены гены и мутации, ассоциированные с УПП. Это позволит сделать вывод о фенотипических характеристиках, например, устойчивости к определенному антибиотику, без культивирования на средах с антимикробными препаратами. Сравнение генома конкретного изолята с другими геномами дает информацию об эволюционной истории патогена — о способах приобретения устойчивости и (или) путях распространения инфекции. Применение ПГС для эпиднадзора в глобальном масштабе позволит своевременно узнать о возникновении и распространении устойчивого патогена и начать борьбу с ним.

ВОЗ отмечает следующие возможные пути использования ПГС в общественном здравоохранении:

• идентификация клонов высокого риска в региональном и глобальном масштабе;

• идентификация механизмов УПП, их возникновения, возможных путей передачи устойчивых патогенов от животных или из окружающей среды;

• выявление и отслеживание вспышек;

• определение новых мишеней для противомикробных препаратов и вакцин;

• разработка на основе данных секвенирования инструментов диагностики, пригодных для использования в местах оказания медицинской помощи и быстрого выявления УПП.

В документе подчеркивается, что ПГС не должно и не может полностью заменить фенотипические методы. Так, методы секвенирования не позволяют количественно определять устойчивость (в отличие от разведений или диско-диффузионного метода). Кроме того, вывод, сделанный по геномной последовательности, все же основан на косвенных данных. Результат может быть и ложноположительным, если, например, секвенирование обнаружит неэкспрессирующийся псевдоген, и ложноотрицательным, если гена устойчивости нет в базах. Секвенирование дополняет фенотипические методы, а также существенно экономит время и затраты, позволяя быстро и точно определить некоторые характеристики.

Документ ВОЗ посвящен только секвенированию индивидуальных патогенов, но не методам метагеномики (секвенированию геномов различных микроорганизмов в образце), с помощью которых пока еще трудно определить, какому именно патогену в образце сложного состава принадлежит обнаруженный ген устойчивости. Это также подчеркивает важность традиционной микробиологии, в частности, методов культивирования.

Данные секвенирования должны быть частью метаданных — совокупности геномных, клинических, лабораторных и эпидемиологических данных; такой формат был бы неоценим для здравоохранения и медицинских исследований. Следовательно, для наилучшего использования возможностей ПГС необходимо достаточное количество подготовленного в эпидемиологическом отношении персонала, работающего на местах, чтобы были собраны все необходимые данные.

Применения и ограничения

Прежде всего следует сосредоточиться на одном или нескольких патогенных микроорганизмах, имеющих максимальное значение для общественного здравоохранения, и на хорошо известных механизмах устойчивости. В число важных патогенов, на которые следует обратить внимание в первую очередь, входят, например, туберкулезная палочка, метициллинрезистентный золотистый стафилококк (MRSA), кишечная палочка, резистентная к цефалоспоринам третьего поколения, и др.

Необходимо понимать, что не для всех патогенов предсказания антибиотикорезистентности с помощью ПГС достаточно точны, чтобы использовать их для назначения терапии. Тем не менее выгоды ПГС для клинической практики уже ощутимы, в том числе для более точной постановки диагноза.

В исследованиях некоторых видов бактерий ПГС уже заменяет другие методы типирования с более низким разрешением, такие как гель-электрофорез в импульсном поле, мультилокусный анализ числа тандемных повторов или серотипирование (особенно для микроорганизмов с большим количеством клинически значимых серотипов, таких как сальмонелла). Следует ожидать, что в ближайшем будущем список таких патогенов вырастет.

Число публикаций по полногеномному секвенированию патогенных изолятов стремительно увеличивается. К сожалению, большая часть работ выполнена в странах с высоким доходом, поскольку себестоимость метода относительно высока. (По числу публикаций лидируют с большим отрывом США и Великобритания, Россия на 34-м месте.) Возможно, удешевление технологии сократит этот разрыв. Кроме того, секвенирование может помочь сэкономить средства и время персонала за счет автоматизации, централизации процесса (в лабораториях с высокой производительностью секвенирование обходится дешевле) и уменьшения количества необходимых фенотипических анализов. Соображениям экономической эффективности использования ПГС для надзора за устойчивыми патогенами посвящен особый раздел документа.

Основные ограничения, препятствующие внедрению ПГС — высокие начальные и последующие инвестиции, высокие технологические и инфраструктурные требования. Как правило, лабораториям приходится инвестировать в обучение персонала: многие стандартные программы подготовки не включают современные методы секвенирования. Кроме того, важно стандартизировать технологии, чтобы с уверенностью сравнивать результаты разных лабораторий, от получения штаммов надлежащего качество до протоколов, алгоритмов биоинформатики и программного обеспечения, а стандартизация тоже требует усилий и вложений.

Существуют и объективные ограничения. Не для всех патогенов устойчивость можно определить с помощью методов секвенирования из-за нехватки данных. Кроме того, обмен данными в настоящее время не является общепринятой практикой, а это снижает эффективность метода.

Если необходимо быстро подтвердить или исключить присутствие конкретных генов в образце, более эффективными, чем ПГС, могут оказаться другие методы молекулярной диагностики: таргетное секвенирование (секвенирование определенного гена или области) или скрининговая ПЦР. Иногда проще детектировать белки патогена с помощью быстрого иммунохроматографического анализа (ИХА).

В документе рассматривается применение полногеномного секвенирования в эпиднадзоре за УПП местными, региональными, национальными референсными лаборатории, а также в международных исследованиях. Местные лаборатории с помощью ПГС могут идентифицировать известные и открывать новые механизмы устойчивости, расследовать локальные вспышки, например, в больницах. Региональные лаборатории могут также сравнивать геномы из разных источников и устанавливать пути передачи; авторы документа приводят примеры подобных расследований на местном и региональном уровнях. На национальном уровне может осуществляться мониторинг разнообразия патогенов, детекция клонов высокого риска, скорости распространения опасных патогенов и оценка эффективности принятых мер.

Инструменты

Отдельно обсуждаются рабочие процессы, оборудование, навыки персонала и программное обеспечение, необходимые лабораториям, которые собираются внедрять ПГС устойчивых патогенов.

Платформы для коротких чтений (приборы Illumina, ThermoFisher) обладают высокой точностью, однако могут оставлять пробелы в секвенированных геномах, поскольку небольшие фрагменты в сложных областях, богатых повторами, бывает трудно собрать.

Платформы для длинных чтений, которые генерируют последовательности более 10 000 пар оснований, могут преодолеть эти недостатки, поэтому они полезны для получения полных последовательностей геномов и внегеномных элементов. Это в первую очередь инструменты Pacific Biosciences (PacBio) и Oxford Nanopore Technologies (ONT). Платформа PacBio основана на разновидности подхода «секвенирование путем синтеза» и обеспечивает очень короткое время выполнения. Однако эти секвенаторы не подходят для новых или небольших лабораторий из-за высокой стоимости инструментов и реагентов, их уязвимости к фрагментации ДНК, большого размера и более высокой частоты ошибок.

ONT разработала новую технологию нанопорового секвенирования, в которой отдельные молекулы ДНК или РНК проходят через белковую нанопору, а изменения электрического тока, проходящего через ту же пору, конвертируются в информацию о нуклеотидной последовательности ДНК. Секвенаторам ONT требуется значительно больше ДНК-мишени, чем секвенаторам для коротких чтений, и частота ошибок у них относительно высока. Однако по мере совершенствования устройств ONT они могут стать разумной альтернативой для новых лабораторий секвенирования, поскольку не требуют значительных инвестиций и могут использоваться там, где регулярно возникают перебои с электроэнергии. С другой стороны, анализ и сборка длинных чтений требуют доступа к адекватным высокопроизводительным вычислительным средам.

Высокий уровень ошибок можно преодолеть путем параллельного выполнения коротких чтений, в идеале на том же образце ДНК. Полезен для работы со сложными бактериальными геномами и мегаплазмидами метод гибридной сборки коротких и длинных считываний. Однако проведение секвенирования двумя методами требует дополнительных затрат.

Недостаточно приобрести секвенатор, если нет других элементов инфраструктуры, подчеркивается в документе. Особо отмечается необходимость квалифицированных специалистов по биоинформатике. Обсуждаются преимущества и недостатки ПО открытого доступа по сравнению с проприетарным программным обеспечением

Ожидается, что стоимость ПГС будет продолжать снижаться по мере того, как растет использование секвенирования в медицине — не только патогенов, но и геномов человека в медицинских целях, говорится в заключении. Тот факт, что многие страны внедряют или планируют внедрять ПГС в свои системы эпиднадзора за УПП, дает возможность для высокого уровня стандартизации. Первым шагом может быть ПГС нескольких приоритетных патогенов GLASS. Результат таких инициатив могут быть ощутимы на мировом уровне, поскольку многие устойчивые патогены в странах с низким и средним уровнем дохода, имеют неизвестные механизмы устойчивости, а сейчас они ускользают от эпиднадзора.