Новые системы CRISPR-Cas9 для редактирования патогенных вариантов

Команда под руководством исследователей из Института Брода и Калифорнийского университета в Беркли разработала системы CRISPR-Cas9, которые расширяют диапазон таргетинга редакторов оснований, а следовательно, и число патогенных вариантов, которые возможно исправлять. Работа опубликована в Nature Biotechnology.

Добавить в избранное

Вам будет интересно

15.04.2024
270
0

В новой работе ученые показали, что озон нарушает двойные связи в половых феромонах дрозофил, из-за чего стираются межвидовые границы. При небольшом повышении уровня озона самцы дрозофил утрачивают предпочтение к самкам своего вида, в результате чего чаще рождаются гибриды, в том числе стерильные. Рост уровня озона все чаще регистрируется в жаркие дни, и авторы исследования считают, что этим можно объяснить снижение числа насекомых. Подробнее

Секвенировав более сотни геномов многоклеточных водорослей, ученые показали, что многоклеточность развилась в трех линиях водорослей независимо. Многоклеточные водоросли отличаются от одноклеточных наличием генов клеточной адгезии, клеточной дифференциации, межклеточных коммуникаций и межклеточного транспорта. Эти гены были обнаружены у вирусов, заражающих водоросли. Ученые предположили, что критическим фактором обретения многоклеточности был горизонтальный перенос генов от вирусов к водорослям. Подробнее.

До сих пор не совсем понятно, как плохая диета и ожирение связаны с повышенным риском рака. Ученые показали, что клетки людей с мутациями в гене BRCA2 особо чувствительны к метилглиоксалю — веществу, которое образуется в организме при переработке глюкозы. Оно может нарушать целостность ДНК и индуцировать рак. Предположительно, у людей без мутации в BRCA2, но с повышенным из-за диабета уровнем метилглиоксаля тоже могут образовываться такие нарушения — признаки повышенного риска развития рака. Подробнее.

Дороги, заборы, города и другие сооружения препятствуют миграции антилоп гну. Ученые показали, что это плохо сказывается на их генетическом здоровье. Снижается генетическое разнообразие, популяции становятся более генетически изолированными, повышается уровень инбридинга. Все это приводит к худшей выживаемости, особенно в условиях изменяющегося климата. Подробнее.

Бонобо долгое время считались более миролюбивыми, чем шимпанзе. Однако долговременное наблюдение за всеми контактами 12 самцов бонобо и 14 самцов шимпанзе в природе показало, что это не совсем так. Оказалось, что самцы бонобо чаще, чем шимпанзе, проявляли агрессию по отношению к другим самцам (в 2,8 раза). В то же время самцы бонобо реже атаковали самок, но самки чаще атаковали самцов. Ученые объясняют это тем фактором, что самки бонобо чаще стоят на более высокой социальной ступеньке, чем самцы. Подробнее.

05.04.2024
524
0

Срок жизни ядерной ДНК нейронов может быть таким же, как у организма в целом, а РНК, как правило, недолговечны, однако из всякого правила есть исключение. Авторы новой статьи в Science обнаружили, что долгоживущие РНК (LL-RNA) в клетках мозга мыши сохраняются и остаются функциональными более двух лет, то есть практически всю жизнь животного.

Исследователи метили РНК мышат 5-этинилуридином, что позволяло отслеживать конкретные молекулы длительное время. «К нашему удивлению, уже первые изображения показали присутствие долгоживущих РНК в различных типах клеток мозга. Нам пришлось дополнительно проанализировать данные, чтобы идентифицировать те, которые находятся в нервных клетках», — рассказывает один из руководителей работы Мартин Хетцер.

Долгоживущие РНК представляли собой смесь мРНК и некодирующих РНК, колокализованных в области гетерохроматина. За два с половиной года жизни мышей их концентрации снизились, но даже к концу этого срока они не исчезли. Исследователи получили in vitro модель мозга из стволовых клеток — предшественников нейронов и ингибировали в них экспрессию долгоживущих РНК, чтобы определить их функцию. ДНК в модифицированных клетках стала нестабильной, нарушилась архитектура гетерохроматина. Долгоживущие РНК, вероятно, вместе с неопознанными белками образуют стабильную структуру, которая каким-то образом взаимодействует с гетерохроматином, и этот процесс может быть необходим для обеспечения рекордной продолжительности жизни нервных клеток.

28.12.2023
535
0

Синтез хромосом de novo — длительный и затратный процесс, что ограничивает его применение в научных исследованиях и биотехнологии. Коллектив из Южно-Калифорнийского университета предложил альтернативу — создание синтетических хромосом дрожжей из природных фрагментов. Метод получил название  CReATiNG (от Cloning, Reprogramming, and Assembling Tiled Natural Genomic DNA).

Первый этап CReATiNG — клонирование сегментов природных хромосом. На этом шаге к концам сегментов добавляют уникальные адаптерные последовательности, определяющие, как молекулы будут рекомбинировать друг с другом в ходе дальнейшей сборки. Второй этап — совместная трансформация клонированных сегментов в клетки и их сборка путем гомологичной рекомбинации in vivo. Такой подход значительно дешевле и быстрее, чем сборка из синтезированных de novo фрагментов. Например, некоторые синтетические хромосомы, созданные авторами статьи, прошли путь от разработки in silico до тестирования in vivo в течение месяца, а их производство обошлось менее чем в пятьсот долларов.

Ученые показали, что CReATiNG можно использовать для создания синтетических хромосом со сложным дизайном, включающим более десяти сегментов. Кроме того, подход можно комбинировать с синтезом хромосом de novo. Например, хромосомы со свойственной дрожжам архитектурой, но с последовательностями из других видов, могут быть синтезированы de novo, а затем рекомбинированы с хромосомами дрожжей — это упростило бы изучение генетических основ репродуктивной изоляции и различий в признаках между филогенетически далекими организмами. Также с помощью CReATiNG можно собирать единые модули из генов, относящихся к одним и тем же сигнальным путям и клеточным процессам, что важно для их исследования.

04.10.2023
769
0

Экспрессия генов с плазмидной ДНК после трансфекции, как правило, носит временный характер. Механизм, который ее прекращает, пока не был точно установлен, однако недавно ученые описали новый компартмент в клетках млекопитающих, который содержит внехромосомную ДНК. Они показали, что ДНК, попадающая в клетки, быстро окружается двойной мембраной в цитоплазме — полученный контейнер хранится в клетке несколько циклов деления.

Эксклюсома — так авторы назвали новый компартмент — содержит в оболочке белки эндоплазматического ретикулума (ЭПР), а также белки внутренней ядерной мембраны Lap2β и эмерин. Исследователи предположили, что упаковка внехромосомной ДНК в эксклюсомы происходит при участии ЭПР (об этом говорит наличие белков ЭПР в ее мембране и контакты эксклюсом с ЭПР), однако сама оболочка сильно напоминает ядерную. Отличие состоит в отсутствии рецептора ламина B и ядерного порового комплекса. Однако, несмотря на отсутствие ядерных пор, обмен между эксклюсомой и цитоплазмой остается возможен — это обеспечивается фенестрациями мембраны.

Важную роль в формировании эксклюсомы играет белок эмерин. Ученые подтвердили это при помощи оверэкспрессии LEM-домена, который участвует в связывании эмерина с BAF (ДНК-связывающий белок). Такая оверэкспрессия препятствовала связыванию полноразмерного эмерина с его мишенью; оказалось, что это ограничило образование эксклюсом. Каким именно образом клетки различают внехромосомную ДНК и хромосомы, исследователи пока не выяснили. Сама способность клеток к упаковке плазмид в эксклюсомы (последние также могут содержать кольцевую ДНК, происходящую из теломер) говорит о существовании сложных механизмов, защищающих клетки млекопитающих от экзогенной ДНК. Авторы работы рассчитывают, что дальнейшие исследования раскроют детали работы этого механизма, его эволюционный путь и то, как он координируется с теми системами иммунитета, которые возникли благодаря многоклеточности.

02.10.2023
491
0

Некодирующие РНК (нкРНК) привлекают все больше внимания в связи с их ролью в регуляции различных процессов и вовлеченностью в патогенез. Изучение их функций открывает возможности для диагностики и терапии многих заболеваний, однако классический подход к анализу, основанный на ингибировании функции, затруднен из-за сложности доставки антагонистов нкРНК и возможных неспецифических эффектов. Решение этой проблемы предложили российские ученые, отредактировав последовательности генов некодирующих РНК при помощи двух вариантов CRISPR/Cas9.

Авторы работы использовали программируемую нуклеазу дикого типа (SpCas9wt) и мутантный вариант, вносящий одноцепочечные разрывы (так называемую никазу, SpCas9D10A). С их помощью они отредактировали последовательности генов нкРНК, связанных с фиброзом, в мезенхимальных стромальных клетках (МСК) человека. В качестве мишеней ученые выбрали гены, кодирующие микроРНК, — hsa-miR-21-5p и hsa-miR-29c-3p. Они показали, что с помощью SpCas9 можно достаточно успешно (с эффективностью до 50%) отредактировать в иммортализованных МСК гены нкРНК и не затронуть делецией фрагменты между целевыми участками. Также исследователи проверили воздействие никазы SpCas9D10 на клетки-мишени — оказалось, что она позволяет эффективно редактировать целевые гены, приводя преимущественно к микроделециям или копированию фрагментов генов. Важно, что полученные с помощью никазы изменения генома снижают экспрессию целевых нкРНК.

Помимо снижения количества нокаутированных нкРНК в самих стволовых клетках и продуцируемых ими внеклеточных везикулах, проведенное редактирование изменяло физиологию МСК и свойства их секретома. Полученные данные указывают на роль hsa-miR-21-5p и hsa-miR-29c-3p в поддержании мультипотентности МСК — при нокауте этих нкРНК клетки приближались по фенотипу к миофибробластам. Кроме того, выделяемые ими внеклеточные везикулы менее эффективно препятствовали развитию фиброза, чем везикулы от клеток дикого типа. Исследователи сообщают, что полученные результаты хорошо коррелируют с ранее опубликованными данными. Они надеются, что предложенный ими подход может быть использован для нокаутирования генов нкРНК в геномах МСК или аналогичных типов клеток и позволит изучать их функции в биологических процессах.