Меню
Все темы
Японские ученые изобрели наноразмерный нагреватель для расплавления нитей ДНК
Исследователи из Университета Осаки разработали технологию, упрощающую разделение нитей ДНК для нанопорового секвенирования. Их изобретение представляет собой платиновую наноспираль, окружающую нанопору в мембране из нитрида кремния (SiNХ). Когда двунитевая ДНК достигает нанопоры, на нагреватель подается напряжение, и слабый нагрев бережно расплавляет ДНК. Эта концепция может быть полезной для секвенирования в твердотельных порах.
«Ключевое преимущество нового метода заключается в том, что нам не нужно нагревать весь образец, а только очень небольшую его часть, — объясняет первый автор Макусу Цуцуи. — Это означает, что для процесса требуется всего несколько милливатт мощности, повреждение ДНК сводится к минимуму, и мы можем считывать информацию с ДНК более точно».
Исследователи протестировали свой метод на ДНК фага лямбда длиной почти 50 т.п.н. и на более короткой кольцевой плазмиде pBR322. Новый подход позволял не только разделять цепочки ДНК, но и контролировать этот процесс, а также оценивать воздействие на движение ДНК электрических сил, сопротивления вязкой среды и температуры.
«Наше устройство должно быть простым в изготовлении, и мы надеемся, что оно станет базовой технологией для быстрого и точного секвенирования следующего поколения», — говорит руководитель работы Томодзи Каваи и добавляет, что оно хорошо подходит для использования в портативных диагностических приборах.
Вам будет интересно
458
0
272
0
Скончался доктор химических наук, профессор, академик РАН Евгений Давидович Свердлов. Он много лет работал в Институте биоорганической химии РАН, занимал пост директора Института молекулярной генетики РАН (1988–2006), руководил Центром геномных исследований в НИЦ «Курчатовский институт».
Евгений Давидович Свердлов в 1972–1973 гг. выдвинул и экспериментально обосновал подход к секвенированию ДНК, использующий получение и разделение фрагментов ДНК разной длины. Под его руководством разрабатывались ключевые технологии функциональной и сравнительной геномики, в том числе методы вычитающей гибридизации. В 1980-е годы лаборатории Е.Д. Свердлова, Ю.А. Овчинникова и Р.Б. Хесина исследовали гены бактериальных РНК-полимераз и обнаружили мутации устойчивости к антибиотику в гене этого фермента у туберкулезной палочки. Е.Д. Свердлов клонировал гены интерферона человека, которые внедрили в бактериальные штаммы для промышленного производства. Он внес существенный вклад в реализацию российского проекта «Геном человека».
В последнее десятилетие Е.Д. Свердлов с коллегами занимался разработкой невирусного генотерапевтического противоракового препарата «АнтионкоРАН-М», исследовал потенциал редактирования геномов растений для решения продовольственных проблем, писал книги.
Интервью с Е.Д. Свердловым на нашем портале (беседовала Наталия Лескова)
Евгений Свердлов: «Это было особое время большого энтузиазма в науке»
443
0
Шолто Дэвид, молекулярный биолог, известный своими расследованиями ошибок и фальсификаций в научных статьях, обнаружил очередную проблему — более чем в 50 работах по клеточной сенесценции, вероятно, использовались не те антитела для идентификации ключевого белка.
Характерный признаков сенесцентных («стареющих») клеток — активность фермента β-галактозидазы. На этом основан один из методов их выявления в культуре — обработка хромогенным субстратом X-gal приведет к тому, что в сенесцентных клетках он расщепится β-галактозидазой и образует нерастворимый осадок синего цвета. Этот фермент можно выявлять и другими методами, например, иммуноокрашиванием или вестерн-блоттингом, то есть с помощью антитела. И Шолто Дэвид пишет в своем блоге о том, что авторы ряда статей сообщают об использовании антитела, специфичного к β-галактозидазе кишечной палочки — ферменту с той же функцией и сильно отличающейся последовательностью. Между β-галактозидазой у кишечной палочки и млекопитающих недостаточно гомологии (около 20%), поэтому антитело к первому из этих белков не будет связываться со вторым.
Работы, где была замечена ошибка в выборе антител к β-галактозидазе, Дэвид собрал в общедоступный список — сейчас он насчитывает 54 публикации. Первую из таких статей, вышедшую в Cell в 2016 году, исследователю прислали вскоре после того, как в июне он рассказал об еще одной (более масштабной) путанице с антителами.
Ранее он писал, что более чем в трехстах работах произошла путаница, и вместо онкосупрессора p16 ученые «искали» в сенесцентных или опухолевых клетках компонент актинового цитоскелета с похожим названием. Вместо антител к p16-INK4a — это полное название онкосупрессора — во многих работах упоминались антитела к p16-ARC, который не участвует в контроле клеточного цикла или старении. Некорректное использование Дэвид нашел в 95% случаев, просмотрев 334 доступных статьи — сам он называет это «поистине поразительной ошибкой».
726
0
Направленная вставка крупных фрагментов ДНК в геном остается нерешенной задачей генного редактирования. Недавно было показано, что с помощью сериновых рекомбиназ семейства IS110 («мостиковые рекомбиназы») можно редактировать протяженные участки генома. Теперь в Science вышла статья, посвященная применению мостиковой рекомбиназы для редактирования генома в клетках человека. Руководитель исследования — Мартин Йинек, соавтор знаменитой нобелевской статьи Дженнифер Дудны и Эмманюэль Шарпантье про CRISPR-Cas9.
Вдохновившись первоначальным открытием мостиковых рекомбиназ, авторы статьи создали на их основе систему редактирования генома млекопитающих. Они использовали рекомбиназу ISCro4 из Citrobacter rodentium, которая обладала высокой активностью в клетках человека. Ученые разделили гидовые «мостиковые» РНК на отдельные петли связывания с таргетной и донорной ДНК (конструкция получила название split-bridge).
Полученная система обеспечивала безопасную вставку участков длиной в несколько килобаз, а также направленные делеции и инверсии в известных локусах, связанных с заболеваниями. Ученые добились контролируемого внесения хромосомных делеций протяженностью до 1,6 килобаз, инверсий — до 800 пар нуклеотидов; частота рекомбинации в этих случаях превышала 10%. Длина направленных вставок, протестированных авторами, составила до 3,5 килобаз, а эффективность — более 6%. (Для сравнения — прайм-редактирование обеспечивает вставки в несколько десятков пар нуклеотидов, его модифицированные варианты — в несколько сотен.) Исследователи уточняют: они не оценивали максимальные размеры участка, который можно отредактировать с помощью ISCro4, но предполагают, что система сможет обеспечить перестройки генома до нескольких мегабаз. Авторы работы также охарактеризовали специфичность редактирования и нецелевую активность. Они пришли к выводу, что ISCro4 — перспективная основа для создания нового поколения инструментов геномного редактирования.
970
0
Система CRISPR-Cas широко применяется в генной инженерии, а теперь еще и для терапии наследственных заболеваний. Однако наиболее хорошо охарактеризованные Cas-белки — SpCas9 из Streptococcus pyogenes и AsCas12a из Acidaminococcus sp. BV3L6 — слишком велики, чтобы поместиться в аденоассоциированный вирусный вектор со всеми вспомогательными элементами, а разделение их на части снижает эффективность. Все больше внимания уделяется компактным Cas-белкам, включая AsCas12f1 из Acidibacillus sulfuroxidans (422 аминокислоты). Исследователи из США модифицировали AsCas12f1, чтобы повысить ее эндонуклеазную активность, и получили enAsCas12f, эффективность которой в 2–11 раз выше, чем у белка дикого типа.
Авторы повысили аффинность AsCas12f1 к нуклеиновым кислотам, заменив некоторые ее аминокислоты на положительно заряженные. AsCas12f1 вносит инделы в менее 20% таргетируемых сайтов, а enAsCas12f — до 69,8%. При этом размеры AsCas12f1 не превышают треть SpCas9. Активность AsCas12f1 была продемонстрирована на нескольких типах клеток человека. Увеличение эффективности нуклеазы не повысило ее нецелевую активность. Криоэлектронная микроскопия помогла получить структуру комплекса AsCas12f–гидРНК–ДНК с разрешением 2,9 Å. Гидовую РНК тоже оптимизировали, новая версия на 33% короче изначальной, но при этом обладает сопоставимой активностью.
