Альтернативный путь удлинения теломер в раковой клетке связан с «залипанием» белков на ДНК

Авторы новой работы, опубликованной в Nucleic Acid Research, показали, что в раковых клетках с дефицитом белка ATRX усиливается связывание белков с ДНК, что приводит к остановке вилки репликации и активирует альтернативный путь удлинения теломер.

При каждой новой репликации эукариотическая ДНК теряет небольшой концевой участок хромосомы, из-за чего число делений клетки ограничено (так называемый лимит Хейфлика). На концах хромосом расположены теломеры — области тандемных повторов TTAGGG общей длиной в тысячи оснований, связанные с белковым комплексом шелтерином.

Огромный интерес к теломерам определяется их участием в процессах старения и развития злокачественных новообразований. Известно, что клетки опухолей способны удлинять свои теломеры. Как правило, это связано с усилением активности теломеразы — специализированного рибонуклеопротеина, который постепенно добавляет теломерные повторы к концам хромосом. Однако при некоторых видах рака клетки используют так называемый альтернативный механизм удлинения теломер (ALT). В его основе лежит аберрантная рекомбинация теломер и консервативный синтез ДНК, известный как репликация, индуцированная разрывом (BIR). Путь ALT характерен для раков мезенхимального происхождения (например, остеосаркоме) и некоторых видов рака центральной нервной системы, таких как глиобластома.

Почти все клетки, у которых отмечен ALT, не способны экспрессировать ген ATRX и связанный с ним DAXX, однако механизмы участия ATRX/DAXX в удлинении теломер пока не ясны.

ATRX — мультифункциональный белок: это фактор ремоделирования хроматина, участвующий в связывании гистонов с определенными участками генома (включая теломерный хроматин), они играет определенные роли в репликации ДНК, а также поддерживает стабильность генома, в том числе стимулируя репарацию двухцепочечных разрывов ДНК.

В новой статье показано, что в клетках с дефицитом ATRX к запуску ALT приводит прочное связывание белков с ДНК. С клеточной ДНК всегда работает множество белков, и эти тесные взаимодействия создают риски образования ковалентных поперечных связей ДНК-белок либо прочного нековалентного захвата белков ДНК. Риски усиливают ультрафиолет, ионизирующая радиация — а также многие химиотерапевтические препараты. (С другой стороны, многие ALT-раки чувствительны к таким препаратам.)

Авторы сравнивали известную линию клеток HeLa с длинными теломерами (в них индуцируется ALT из-за отсутствия гистонового шаперона ASF1) и линии, которые создали они сами с помощью CRISPR/Cas9-нокаута ATRX. Полученные клоны не имели характерных маркеров ALT. Однако под действием пиридостатина (агента, который стабилизирует G4-квадруплексы — вторичные структуры в ДНК) маркеры наблюдались в клетках с нокаутом ATRX, но не в клетках с ATRX дикого типа; также у них появились признаки хрупкости теломер (что может быть связано с застреванием репликативных вилок).

Некоторые другие химиотерапевтические агенты также индуцировали ALT в клетках HeLa, в которых отсутствует ATRX, но не в клонах с ATRX дикого типа. Тот же эффект наблюдался, когда клоны с истощением ATRX обрабатывали формальдегидом, индуцирующим перекрестные связи между белком и ДНК.

С помощью иммунофлюоресцентного анализа FISH авторы подтвердили, что ATRX рекрутируются к богатым GC-парами и повторами областям ДНК (прежде всего теломерам) и участвуют в разрешении неканонических G4-структур в них.

Возникновение неканонических структур ДНК, такие как G4, требуют вмешательства топоизомераз, в частности, топоизомеразы 2А (TOP2А). Ее захват способствует индукции ALT в нокаутированных по ATRX клетках, как и захват ряда других белков, например PARP1 (ключевая молекула ответа на повреждения ДНК). Авторы сочли возможным, что захват топоизормераз и PARP1 на ДНК — решающий этап в инициации ALT.

Развитие ALT также зависит от активности эндонуклеазы MUS81, снижающей избыточную суперспиральность ДНК. Авторы вызвали нокдаун гена, кодирующего MUS81, с помощью малых интерферирующих РНК; клетки с таким нокдауном имели лишь слабые признаки ALT.

Наконец, ученые выяснили, что недостаток ATRX приводит к повышению уровня белков, захваченных на ДНК, и это коррелирует также с активацией ALT. Интересно, что линия с нокдауном ASF1 тоже продемонстрировала увеличение ковалентного захвата TOP1 и одновременную индукцию ALT.

Таким образом, показано большое значение удержания белков на ДНК для альтернативного удлинения теломер при развитии рака. Авторы предлагают модель, согласно которой в отсутствие ATRX или DAXX репликативные вилки становятся нестабильными при встрече с захваченным белком. Таким образом, потеря функции ATRX однозначно опасна, поскольку способствует активации альтернативного пути удлинения теломер.

Теломераза делает старение клеток безопаснее