Антисмысловая терапия восстановила работу нейронов при синдроме Тимоти

Синдром Тимоти — это наследственное мультисистемное заболевание, для которого характерны аутизм, эпилепсия, приступы гипогликемии, нарушения работы сердца и иммунной системы. Синдром Тимоти 1 типа вызывается гетерозиготной миссенс-мутацией c.1216G>A в экзоне 8А гена CACNA1C, который кодирует субъединицу потенциалзависимого кальциевого канала Ca_V1.2. Выделяют также синдром Тимоти 2 типа, при котором та же мутация находится в экзоне 8. В настоящее время для лечения синдрома Тимоти применяют блокаторы кальциевых каналов, однако такая терапия неэффективна. Ученые из Стенфордского университета предложили лечить синдром Тимоти 1 типа с помощью антисмысловых олигонуклеотидов, которые блокируют экзон 8А и способствуют экспрессии экзона 8 в гене CACNA1C.

В работе ученые использовали индуцированные плюрипотентные клетки (иПСК), полученные от пациентов с синдромом Тимоти 1 типа. Их они дифференцировали в нейроны коры головного мозга и использовали для выращивания 2D культур, органоидов и ассемблоидов. Проведя скрининг антисенс-олигонуклеотидов на 2D клеточных культурах, исследователи отобрали те из них, которые блокируют экзон 8А и не влияют на экзон 8 в гене CACNA1C, а затем перешли к экспериментам на органоидах и ассемблоидах. Ученые также провели тесты на крысах, которым трансплантировали кортикальные нейроны, полученные от людей с синдромом Тимоти.

Для начала ученые подтвердили, что развитию синдрома Тимоти способствует экспрессия именно экзона 8А. Используя 2D и 3D культуры нейронов коры головного мозга человека, они показали, что в норме экзон 8А экспрессируется только на ранних стадиях развития, а со временем начинает преобладать экспрессия экзона 8. Однако при синдроме Тимоти 1 типа даже на 60–90 дней после дифференцировки нейронов повышен уровень экспрессии экзона 8А. Более того, мутантный аллель в этом экзоне напрямую способствует экспрессии именно этого экзона вместо нормального экзона 8. На это не влияет клеточный контекст, как показали эксперименты, в которых генетические конструкты, несущие оба экзона дикого типа либо с мутацией, доставляли в клетки HEK293T.

Далее исследователи провели скрининг антисмысловых олигонуклеотидов, несущих модифицированную рибозу — 2'-O-метоксиэтилрибозу (модификация нужна, чтобы предотвратить деградацию мРНК целевого гена). Действие антисенс-олигонуклеотидов проверяли на 2D культурах нейронов, полученных от людей с синдромом Тимоти, а в качестве контроля использовали олигонуклеотид со случайной последовательностью. В результате ученые отобрали четыре антисенс-олигонуклеотида, которые снижали экспрессию экзона 8А, не влияя на экзон 8. Их также протестировали на 3D органоидах — на них воздействовали олигонуклеотидами в течение трех дней. Наилучшие результаты показали три из четырех отобранных олигонуклеотидов: они успешно подавляли экзон 8А в органоидах кортекса, полученных от трех пациентов с синдромом Тимоти. При этом действие антисмысловой терапии было длительным: после одной дозы антисенс-олигонуклеотидов эффект сохранялся в течение 90 дней. Переключение с экзона 8А на 8 не влияло на общий уровень кальциевого канала, а in vitro тесты не выявили токсичности полученных антисенс-олигонуклеотидов. Они также оказались неиммуногенными и не имели внецелевой активности.

При синдроме Тимоти в нейронах коры головного мозга замедляется инактивация бариевых токов, а после деполяризации мембраны увеличивается внутриклеточная концентрация кальция. При этом правильной работе кальциевого канала Ca_V1.2 может помешать даже небольшое количество мутантного белка. Однако все три антисенс-олигонуклеотида успешно восстанавливали активность Ca_V1.2 в кортикальных нейронах, моделирующих синдром Тимоти. После применения олигонуклеотидов остаточный уровень кальция в клетках восстанавливался до нормального, а также исчезла задержка в инактивации бариевых токов.

Для синдрома Тимоти также характерно нарушение миграции интернейронов — нейронов, которые соединены только с другими нейронами. Чтобы оценить влияние антисмысловой терапии на такие нарушения, исследователи использовали ассемблоид переднего мозга, полученный из иПСК от пациентов с синдромом Тимоти. Через 2 недели после введения антисенс-олигонуклеотидов в интернейронах нормализовалось сальтаторное поведение, т. е. скачкообразное распространение нервного импульса по аксонам.

Исследователи также показали трансляционный потенциал антисмысловой терапии синдрома Тимоти. Для этого они трансплантировали в мозг крыс кортикальные нейроны от трех пациентов с этим заболеванием. Затем животным интратекально (в подоболочечное пространство мозга) ввели антисенс-олигонуклеотиды, а через 1–2 недели провели анализ трансплантированных нейронов. После антисмысловой терапии в трансплантате снизилась экспрессия экзона 8А. Тот же эффект был достигнут в коре головного мозга и мозжечке крыс, что связано с высокой гомологией крысиного гена Cacna1c и человеческого CACNA1C. Кроме того, антисмысловая терапия нормализовала остаточную внутриклеточную концентрацию кальция после деполяризации кортикальных нейронов, а также исправила дефекты в морфологии дендритов интернейронов.

Антисмысловая терапия синдрома Тимоти 1 типа способствовала преимущественной экспрессии экзона 8А в гене CACNA1C. Однако сейчас олигонуклеотиды не «различают» экзон 8А в гене дикого типа и в мутантном гене, что ученые намерены исправить за счет изменения длины олигонуклеотидов или введения химических модификаций. Авторы работы также отметили, что следует оценить влияние антисмысловой терапии на работу сердца, также используя органоиды, и проверить ее токсичность in vivo. В будущем они планируют выяснить, характерен ли аномальный сплайсинг экзонов 8 и 8А для синдрома Тимоти 2 типа и можно ли решить эту проблему с помощью антисмысловых олигонуклеотидов.

Глухоту с поздним началом можно остановить с помощью антисмысловых олигонуклеотидов